Одной из основных задач любого живого организма является сохранение своего вида. Эта задача решается как путем эволюционной адаптации к условиям окружающей среды, так и размножения, т.е. увеличения численности представителей своего вида. Человек, будучи единственным существом, обладающим самосознанием, может к этой задаче относится так, как ему угодно, но вот существа с менее развитой нервной системой особого выбора не имеют. Несмотря на мнимый примитивизм многие представители фауны, как и люди, очень тщательно относятся к вопросу выбора партнера и, как следствие, будущего отца или матери потомства. Чаще всего привлечением партнера занимаются самцы, показывая свою силу в дуэлях с конкурентами, строя невероятные гнезда или же напевая самую громкую (не всегда самую мелодичную) песню. Тем не менее у некоторых видов все же самкам приходится привлекать самцов. К примеру, самцы пауков вида Steatoda grossa (стеатода крупная) чаще всего погибают сразу после спаривания, что, согласитесь, не самая радужная перспектива, но они все же не могут устоять перед зазываниями самок. Ученые из университета Саймона Фрейзера (Канада) решили выяснить, что именно используют самки S. grossa для эффективного завлечения самцов. Короткий ответ — феромоны, но, как и все в природе, это лишь верхушка айсберга. В чем секрет феромонов S. grossa и как именно они их используют? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Стеатода крупная (Steatoda grossa) — это вид пауков из рода Steatoda, обитающий практически везде. Альтернативное название вида звучит как «ложная черная вдова», что вызвано визуальным сходством между двумя видами.


Сравнение внешнего вида самки (слева) и самца (справа) пауков Steatoda grossa.

Как и у многих пауков, самки S. grossa гораздо крупнее самцов (6-10.5 мм против 4-6 мм). Пауки вида S. grossa довольно выносливы и могут прожить без пищи в течение нескольких месяцев при условии наличия воды. Самцы уступают самкам не только в габаритах, но и в продолжительности жизни: самки — до 6 лет, а самцы — до 1.5 лет. Когда самка решает завести потомство, она привлекает самца с помощью феромонов, о чем мы дальше поговорим подробнее. После удачного спаривания самка может отложить порядка 100 яиц, хранящихся в коконе. Самец же чаще всего погибает и, вероятнее всего, становится кормом для самки. Спустя месяц, если условия окружающей среды подходящие, на свет появляются паучата.

Говоря о поисках партнера, стоит учесть, что этот процесс у разных видов задействует одну из (или комбинацию нескольких) форм передачи сигналов: химическая, слуховая, визуальная, вибрационная и т.д.

Химические вещества, такие как феромоны, считаются древнейшей формой межполовых коммуникативных сигналов и эволюционировали у различных таксонов животных, включая млекопитающих, многоножек, ракообразных и насекомых. Переносимые по воздуху феромоны выполняют сигнальные функции в контексте агрегации, территориальной маркировки, предупреждения, защиты гнезда и размножения. Летучие половые феромоны привлекают потенциальных партнеров, тогда как связанные с кутикулой феромоны распознавания партнеров обеспечивают репродуктивную изоляцию и видообразование насекомых.

Половые феромоны наиболее широко изучались у насекомых. Жуки, мотыльки, муравьи и осы производят и выделяют феромоны из определенных желез, расположенных в различных частях их тела. Многие насекомые могут активно определять время производства и выделения феромонов, а также модулировать количество выделяемых ими феромонов. Но вот у пауков, коих насчитывается более 46 000 видов, на сегодняшний день идентифицировано только 12 половых феромонов, и ни место их образования, ни место их получения неизвестно.

Среди пауков есть виды, которые создают или не создают паутины. Касательно первых можно сказать, что они являются мультимодальными коммуникаторами, использующими в основном феромональные и вибрационные коммуникативные сигналы. Феромоны играют важную роль во время выбора среды обитания, конкуренции партнеров, ухаживания и выбора партнера. В отличие от насекомых, которые обычно выделяют феромоны из определенных тканей желез, самки пауков откладывают феромоны на своих шелковых паутинах. Их паутины привлекают самцов на большие расстояния и при контакте вызывают у самцов реакцию «ухаживания». На сегодняшний день существует ряд вопросов, связанных с феромонами пауков:

• происходят ли феромоны из шелковой железы пауков;
• связаны ли структурно и функционально компоненты аттрактанта партнера и контактного феромона;
• могут ли самки активно модулировать высвобождение компонентов феромона.

Изображение №1

Компоненты феромонов, которые самки пауков откладывают на свои паутины и которые вызывают ухаживание самцов при контакте, были идентифицированы у линифиевых пауков вида Linyphia triangularis и у черных вдов вида Latrodectus hasselti и L. hesperus.

Самки L. triangularis откладывают ®-3-[®-3-гидроксибутирилокси]масляную кислоту (1 на 1a) на своих паутинах, тогда как самки L. hasselti и L. hesperus откладывают производные серина [N-3-метилбутирил метиловый эфир-O-(S)-2-метилбутирил-L-серина (2 на 1a); Метиловый эфир N-3-метилбутаноил-O-метилпропаноил-L-серина (3 на 1a). И соединение №1, и его мономер распада, ®-3-гидроксимасляная кислота (4 на 1a), вызывают у самцов L. triangularis реакцию ухаживания.

Эти результаты подразумевают, что разрушение компонентов контактных феромонов может привести к образованию более летучих компонентов феромонов, которые затем привлекают самцов. Ученые считают, что потенциальное расщепление метиловых эфиров серина Latrodectus может быть катализировано гидролазой карбоксильных эфиров, которая была обнаружена на паутине L. hesperus.

Поскольку активность ферментов зависит от pH, и самки пауков могут регулировать pH своего шелка, можно предположить, что самки Latrodectus, возможно, модулируют динамику распада своих отложений метилового эфира серина и, таким образом, высвобождение компонентов феромонов, привлекающих партнеров.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые решили изучить свои теории, проведя ряд опытов и наблюдений с участием пауков вида Steatoda Grossa. Поскольку пауки Steatoda и Latrodectus являются близкими филогенетическими родственниками, ожидается, что S. grossa будет продуцировать компоненты феромонов, структурно напоминающие компоненты Latrodectus.

Результаты исследования

Чтобы получить аналит для идентификации компонентов контактного феромона, 93 половозрелым самкам и 70 неполовозрелым самкам позволили в течение трех дней строить свои сети в камере для наблюдений (1b). Затем было выполнено экстрагирование метанолом паутины и анализ экстрактов с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии (GC-MS от gas chromatography–mass spectrometry).

Эти анализы выявили семь соединений (5–11 на 1d; пирролидин-2-он (5), 4-гидроксигидрофуран-2(3H)-1 (6), нонановую кислоту (7), додекановую кислоту (8), 6-метилгептанамид (9), октанамид (10), 4,6-диметилгептанамид (11)), которые были уникальны для половозрелых самок.

Чтобы протестировать соединения 5–11 на их способность вызывать реакцию ухаживания у самцов, ученые обработали один образец бумаги на Т-образной конструкции (1с) синтетической смесью 5–11 (опыт №1) или экстрактом из паутины (положительный контроль; опыт №2). Дополнительно были образцы из контрольной группы, которые не обрабатывались.

Опыты показали, что реакцию ухаживания вызывали только экстракты, но не синтетические эквиваленты изучаемых соединений (1e). Из этого следует, что соединения 5-11 не являются компонентами контактных феромонов.

Ученые предположили, что проблема была в методе исследования (т. е. в GC-MS), а потому провели еще один анализ с помощью HPLC (high-performance liquid chromatography, т. е. высокоэффективная жидкостная хроматография). Был проведен анализ всех 20 выявленных фракций HPLC. Все фракции, которые вызвали ухаживание у самцов затем были проанализированы с помощью HPLC-MS/MS и с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (1H ЯМР).

Анализы HLPC-MS/MS выявили неизвестное соединение (12) с молекулярной формулой C13H23NO5 и ионами фрагментации 186, 274 (M + 1) и 296 (M + Na), что указывает на молекулярную массу 273 (2a). Как молекулярная формула, так и масса молекулы соответствовали метиловому эфиру серина (2) в экстрактах паутины L. hesperus (1а). Однако ЯМР спектроскопия неизвестного соединения №12 не подтверждает функциональность сложного эфира, а анализ GC-MS экстрактов паутины S. grossa не предоставил никаких доказательств присутствия метилового эфира серина.


Изображение №2

Затем ученые предположили, что соединение №12 является кислотой, а не сложным эфиром. Потому была проведена эстерифицикация экстракта неочищенной паутины триметилсилилдиазометаном и повторный анализ аликвоты этого экстракта с помощью GC-MS. В результате было выявлено целых три производных метилового эфира серина (2b; метиловый эфир N-4-метилвалероил-O-бутироил-L-серина (13), N-4-метилвалероил-O-изобутироил-L-серин метиловый эфир (14) и метиловый эфир N-4-метилвалероил-O-гексаноил-L-серина (15)). Это подтверждает прогноз о том, что самки S. grossa продуцируют производные серина с карбоксильной (кислотной) функциональностью, а не с функциональностью метилового эфира.

Чтобы оценить структуру неизвестной кислоты №12, ученые использовали доказательства того, что ее фрагмент массой 186 (2а) также присутствует в метиловых эфирах серина 2 и 3, продуцируемых L. hasselti и L. hesperus (1а). Для фрагмента кислоты №12 с массой 186 это означает, что ацил, связанный с атомом азота, имеет шесть атомов углерода вместо пяти (как в эфирах 1 и 2) с 4 возможными изомерами: 2-, 3- или 4-метилпентаноил и гексаноил. Чтобы молекулярный ион кислоты №12 имел m/z 173, второй ацил, связанный с атомом кислорода, должен иметь только четыре атома углерода либо с бутирильной, либо с изобутирильной конфигурацией. Из восьми возможных синтетических изомеров только N-4-метилпентаноил-O-бутирил-L-серин (12 на 2a) имел спектрометрические характеристики, полностью соответствующие соединению, полученному от S. grossa.

Кроме того, соответствующий синтетический метиловый эфир кислоты №12, метиловый эфир N-4-метилпентаноил-O-бутирил-L-серина, имел спектральные характеристики, полностью соответствующие характеристикам наиболее распространенного метилового эфира серина (13) в этерифицированных экстрактах паутины S. grossa.

Все три производных метилового эфира серина имели схожие масс-спектры (2c), что свидетельствует о консервативной молекулярной структуре с различиями только в ацильных группах молекул. Сложный эфир 13 [индекс удерживания (RI): 1843] и сложный эфир 14 (RI: 1890) имели идентичные масс-спектры (2c), но их разница RI в 43 единицы указывала на метильную ветвь в соединении 13. RI эфира 15 (2074) был примерно на 200 единиц выше, чем у эфира 14, что указывает на присутствие более высокого гомолога с двумя дополнительными атомами углерода. Чтобы присвоить окончательные молекулярные структуры эфирам 13 и 15, ученые синтезировали несколько вариантов.

Из них метиловый эфир N-4-метилвалероил-Оизобутироил-L-серина и метиловый эфир N-4-метилвалероил-Огексаноил-L-серина имели масс-спектрометрические характеристики и характеристики удерживания, полностью соответствующие таковым у производных метилового эфира серина 13 и 15, соответственно, из экстрактов паутины. Кроме того, при HPLC-MS/MS анализе соответствующие синтетические кислоты (2а) имели время удерживания и масс-спектры, полностью соответствующие таковым у экстрактов из паутины S. grossa.

Во время опытов тройная смесь синтетических кислот 12, 16 и 17 вызывала у самцов поведение, сравнимое с таковым в случае применения экстрактов из паутины самок (2d). Это свидетельствует о том, что в этой синтетической смеси присутствовали все основные компоненты контактных феромонов.

Также опыты показали, что семь летучих компонентов (5-11) не вызывали никакой реакции ухаживания (2d) и не усиливали соответствующее действие тройной смеси кислот (12, 16 и 17). Напротив, тройная смесь кислот индуцировала поведение ухаживания дозозависимым образом. Двойные смеси также вызывали подобную реакцию, но их эффективность зависела от компонентов такой смеси. Одиночные смеси (12 и 16) вызывали реакцию ухаживания так же эффективно, как и двойные смеси.

Затем ученые поставили перед собой задачу ответить на еще один крайне важный вопрос — где вырабатываются вышеописанные компоненты феромонов? Ранее попытки ответить на этот вопрос уже были, но дальше теорий и гипотез они не заходили. Одним из самых вероятных вариантов является шелковая железа, но это не было подтверждено на практике.

Для проведения дальнейших анализов ученые подвергали пауков холодной эвтаназии, экстрагировали ткани тела в метанольно-солевом растворе, центрифугировали экстракты и проанализировали аликвоты каждого образца ткани или сами ткани с помощьюHPLC-MS на наличие и количество соединений 12 и 16.


Изображение №3

Поскольку только брюшко, но не головогрудь, у пауков содержало соединения 12 и 16 (3а), было решено провести скрининг брюшной гемолимфы и пяти конкретных тканей брюшной полости, включая все восемь шелковых желез. Проанализировав железы по отдельности было установлено, что постериальная агрегатная железа (производит липкий шелк) либо содержит больше всего соединений 12 и 16, либо является единственной железой, которая их содержит (3c).


Изображение №4

На следующем этапе исследования ученые приступили к выявлению механизма перехода контактного феромона (который на паутине самок) в летучий, способный завлекать самцов на большом расстоянии.

В качестве тестового стимула ученые использовали экстракт паутины (без самой паутины) в камере с воздушным потоком. Так они могли оценить, как может измениться поведение самцов в камере в ответ на улавливаемый ими летучий феромон (4a). Во время тестов было определено, что самцы всегда реагировали на экстракт паутины, но не реагировали на контрольный раствор (4b). Но при использовании смеси летучих соединений 5–11, уникальной для половозрелых самок (1d), и контрольным раствором самцы не проявляли реакции влечения вообще (4b).

Эти данные подразумевают, что компоненты феромонов, привлекающих партнеров, трудно обнаружить и, возможно, они возникают в результате химических реакций, происходящих непосредственно в паутине.

Учитывая, что контактный феромон (соединение 1) пауков L. triangularis распадается на летучий мономерный аттрактант (соединение 4) (1а), можно предположить, что и соединения 12, 16 и 17 у пауков S. grossa также со временем гидролизуется по карбоксиэфирной связи с образованием амида N-4-метилвалероил-L-серина (18) и трех соответствующих карбоновых кислот [масляной (19), изомасляной (20), гексановой ( 21)]. И уже эти летучие кислоты привлекают самцов.

Учитывая сложность количественного определения высвобождения этих кислот с течением времени, ученые вместо этого количественно определили накопление амида 18 в качестве показателя распада компонентов контактного феромона (4с).

Теория распада первичных соединений была подтверждена данными, демонстрирующими значительно более высокий коэффициент распада в экстрактах 14-дневных паутин, чем в экстрактах новых (0-дневных) паутин (4d). Опыты с самцами также подтвердили вышеописанную теорию. Самцов достаточно эффективно привлекала смесь из четырех продуктов распада 18–21 и смесь трех карбоновых кислот 19–21, но не амида 18.

Чтобы окончательно убедиться в верности вышеописанных результатов, ученые провели любопытный полевой тест. Они взяли карбоновые кислоты 19–21, ввели их в раствор минеральных масел, а затем пометили несколько углов в коридорах лаборатории, где активность S. grossa не была ранее зафиксирована. Стоит отметить, что пауки вида S. grossa, хоть и похожи на черных вдов, но не столь опасны для человека и просто обожают жить в наших домах.

В течение 16 недель ловушки с приманкой из карбоновой кислоты поймали девять самцов S. grossa, в то время как контрольные ловушки поймали только одного самца. Этот простой тест подтверждает, что карбоновые кислоты выполняют функцию феромонов, привлекающих самцов (4f).

Ученые предположили, что химическое расщепление компонентов контактного феромона 12, 16 и 17 и высвобождение карбоновых кислот 19, 20 и 21 в качестве компонентов аттрактанта катализируются одним или обоими из двух не исключающих друг друга механизмов: активность паутинной гидролазы сложных эфиров карбоновых кислот (CEH от carboxyl ester hydrolase) и прямое омыление (гидролиз эфира с образованием спирта и кислоты) компонентов контактного феромона. Оба эти механизма зависят от pH.


Изображение №5

Чтобы проверить эту теорию, ученые позволили паукам (70 особей) сплести по 2 паутины. Одну из них использовали для количественного определения компонентов контактного феромона (12, 16 и 17) и продукта распада их амида (18), а другую — для определения ее рН. Анализ данных выявил положительную корреляцию между рН паутины и скоростью химического распада (5a).

Чтобы дополнительно определить, влияет ли pH непосредственно на гидролиз компонентов контактного феромона, к синтетическому соединению 12 применили pH 7 или pH 4, а также апротонный ацетонитрил. В то время как оба буферных раствора давали значительно большую скорость распада, чем апротонный контрольный раствор (5b), размер эффекта был в 10 раз меньше, чем измеренный на паутины. Таким образом, pH как прямого (единственного) фактора недостаточно для катализа гидролиза компонентов контактных феромонов (12, 16, 17) с образованием компонентов аттрактантных феромонов (19–21).

Однако, если бы на паутинах S. grossa присутствовала гидролаза сложных эфиров карбоксиловых кислот (CEH), как на паутинах L. hesperus, тогда pH мог бы влиять на ферментативную активность CEH и, таким образом, на гидролиз компонентов контактного феромона. Поскольку S. grossa и L. hesperus являются близкими филогенетическими родственниками, можно предположить, что они продуцируют не только сходные производные от серина компоненты контактных феромонов, но также сходные или идентичные CEH для их гидролиза.

Чтобы это проверить, ученые извлекли паутину из пауков трех групп:

• взрослая девственная самка L. hesperus (положительный контроль, как известно, имеет CEH);
• полувзрослая половозрелая самка S. grossa (считается, что она еще не произвела CEH);
• взрослая девственная половозрелая самка S. grossa (предполагается, что у нее будет такой же уровень CEH, как у L. hesperus).

CEH присутствовал во всех трех образцах L. hesperus и взрослых особях S. grossa и, что удивительно, также в двух из трех образцов полувзрослых особей S. grossa. Вероятно, это связано с тем, что некоторые паутины были произведены самками, приближающимися к половозрелому состоянию. Предположительно, этот CEH может в зависимости от pH гидролизовать компоненты контактного феромона S. grossa, при этом самки манипулируют активностью фермента, изменяя pH своих паутин. Повышение pH их паутины усилит гидролиз компонентов контактного феромона (5b) и, таким образом, высвобождение компонентов феромона, привлекающего партнера, что сделает их паутину более привлекательной для самцов, ищущих себе пару.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые выявили и проанализировали механизмы, задействованные во время привлечения самцов самками вида S. grossa. В ходе опытов ученые идентифицировали три ранее неизвестных компонента контактных феромонов, полученных из серина, продуцируемых самками S. grossa: N-4-метилвалероил-O-изобутироил-L-серин (соединение 12); N-4-метилвалероил-O-изобутироил-L-серин (соединение 16); N-4-метилвалероил-O-гексаноил-L-серин (соединение 17).

Затем было установлено, эти компоненты происходят из задней агрегированной шелковой железы и, попав в паутину, вызывают ухаживание самцов. Но эти соединения являются лишь предшественниками тех, что реально привлекают внимание самцов. Оказалось, что имеет место функциональный переход этих компонентов контактного феромона в летучие компоненты. В зависимости от pH паутины компоненты контактного феромона гидролизуются по карбоксиэфирной связи и дают три соответствующие карбоновые кислоты, привлекающие самцов. С увеличением рН паутины скорость гидролиза увеличивается, и выделяется большее количество карбоновых кислот. Однако одного pH недостаточно для достижения биологически значимой скорости гидролиза. Данные указывают на то, что гидролиз катализируется ферментом, скорее всего, гидролазой сложных эфиров карбоксиловой кислоты, присутствующей в паутине S. grossa. Эта гидролаза сложного эфира карбоксиловой кислоты, в зависимости от рН, может гидролизовать компоненты контактного феромона, при этом фермент, по-видимому, наиболее активен при рН 7.

Ученые считают, что их открытие имеет огромное значение не только для более детального описания пауков S. grossa, но и других паукообразных. Если S. grossa можно считать модельным образцом в аспекте выработки и распространения феромонов, то и у других родственных видов механизмы этих процессов могут быть либо аналогичны, либо схожи.

К тому же, результаты исследования указывают на то, что самки пауков способны активно регулировать привлекательность своей паутины для самцов, регулируя уровень pH в паутине. На данный момент известно, что такой способностью обладают насекомые, но о пауках подобного ранее не сообщалось. Следовательно, этот труд показывает, что мы еще очень много не знаем даже о тех видах существ, которых, как мы считали, изучили вдоль и поперек.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?