Как знают мои постоянные читатели, кроме основного блога я веду на Хабре ещё один, где публикую переводы с английского, посвящённые строгим IT-темам. 21 января я вывесил там материал об игре «Жизнь» Джона Конвея, рассказывающий о создании минимальной жизнеспособной единицы по правилам этой игры. Активное обсуждение статьи, в котором поучаствовал даже уважаемый Павел Гранковский @Pavgran, коммиттер игры, упоминаемый в посте, вернуло меня к мыслям о сборке минимально жизнеспособного биологического генома. Очевидно, что современные возможности секвенирования ДНК и амплификации генов переводят такую задачу в разряд решаемых. На пути к созданию полностью синтетических организмов следовало бы освоить создание полусинтетических, основой для которых мог бы послужить именно такой минимальный геном. Ниже я расскажу о перепрограммировании геномов, искусственном и естественном редуцировании геномов, а также о перспективах таких исследований.

Прокариоты и эукариоты

Можно допустить, что в эукариотической клетке молекула ДНК выступает в качестве хранилища данных (storage), и для обработки этих данных применяется операционная система — трансляционный аппарат. Как сформулировано здесь, «самовоспроизведение генома включает в себя два взаимосвязанных аспекта: матричный («информационный») и конструктивный («операционный»)».

Обработка материи и обработка информации в клетке — это два неразрывных процесса. Клетка одновременно реагирует на два класса стимулов, которые постоянно воздействуют на неё в течение жизни. Во-первых, это поведенческие стимулы, диктуемые окружающей средой. Во-вторых — генетические; клетка подчиняется экспрессии генов, действующих в её ДНК.

Каждая клетка, как прокариотическая, так и эукариотическая — это активный автономный агент. Наиболее известный лабораторный прокариот — кишечная палочка (E. Coli), а все многоклеточные организмы (и многие одноклеточные) состоят из эукариотических клеток. При этом прокариоты значительно мельче эукариот, а устройство двух этих разновидностей клеток отличается настолько, что вряд ли существует способ синтезировать эукариота из прокариотов. Рассмотрим эти отличия подробнее:

Характеристика

Прокариоты                      

Эукариоты 

 Типы ядра

- Отсутствует полноценное ядро, окружённое мембраной
- Примитивное
- В качестве ядра может выступать нуклеоид или хроматиновый материал                      

 - Полноценное ядро, окружённое мембраной

 Мембрана ядра

- Нет

 - Есть

Хромосомы

 - Обычно одна кольцевая хромосома                          

 - В ядре заключено множество линейных хромосом

 ДНК

 - Не осложнена белками (гистонами).                                     

 - Осложнена простейшими белками (гистонами)

 Плазмиды

- очень распространены

 - редки или отсутствуют

 Упорядочивание генов

 - Линейное

 - В хромосомах присутствуют экзоны и интроны

 Клеточная стенка

- Основным веществом в составе клеточной стенки является муреин      
- у археев есть псевдомуреин                                                      

- Муреин отсутствует
- Клеточная стенка может либо отсутствовать, либо состоять из целлюлозы, хитина, кератинов, т.д.

 Цитоскелет

 - Зачаточный

 - цитоскелет состоит из микроволокон, промежуточных волокон и микротрубочек.

 Рибосомы

 - мелкие (70S)

 - крупные (80S)

 Газовые везикулы

 - Есть 

 - Не наблюдаются

 Жгутики

 - субмикроскопические. Жгутик состоит из единственного волокна белка-флагеллина.
- У некоторых прокариот есть аксиальные нити. 

 - Микроскопические. Мембранносвязанный комплекс состоит из множества микротрубочек.
- У некоторых клеток есть реснички

 Размер клетки

 - 0,2-2 мкм x 2-8 мкм

 - Диаметр более 5 мкм.

 Проницаемость мембраны ядра

 - отсутствует

 - селективная проницаемость

Хлоропласты

 - отсутствуют 

 - есть у растений

 Митохондрии

 - отсутствуют

 - есть у животных и грибов

 Лизосомы и пероксисомы

 - отсутствуют

 - есть

 Генетическая рекомбинация

 - частичная, однонаправленный перенос ДНК

 - мейоз и слияние гамет

Принцип деления клетки

 - Деление надвое

 - В соматических клетках происходит митоз, а при формировании гамет – мейоз.

 Метаболизм

 - Наблюдается огромное разнообразие метаболических путей.
- Некоторые клетки строго или факультативно анаэробны 

 - Метаболизм идёт по общему паттерну. Для большинства организмов типичен гликолиз

 - Преимущественно аэробное дыхание, анаэробов очень мало.

 Встречаемость

 - Встречаются в разнообразных экосистемах, где есть питательные вещества.

 - Встречаются в различных экосистемах, где имеются благоприятные условия.

 Филогенетические группы

 - Бактерии и археи

 - эукариоты, в том числе, протисты, животные, растения и грибы

Как в одноклеточном, так и в многоклеточном режиме клетка получает на вход химические сигналы (в том числе от других клеток) и реагирует на них. У клетки есть сенсоры для обработки различных сигналов; кроме того, многие одноклеточные могут двигаться при помощи жгутиков или ресничек (обладают моторными функциями). Ещё один важный класс реакций на внешние стимулы — это деление (размножение) клеток и апоптоз (запрограммированная гибель).

Структура управления в клетке также организована иерархически (для примера возьмём более простую клетку, прокариотическую). В геноме выделяются функциональные единицы, которые называются опероны, регулоны и модулоны. Опероны координируют работу групп генов, регулоны отвечают за одновременную активацию как оперонов, так и отдельных генов. На высшем уровне этой иерархии находятся модулоны, регулирующие работу регулонов, оперонов и отдельных генов.   

Минимальный геном

В 1999 году минимальный геном был определён как набор генов, необходимый и достаточный для жизни при слабых ограничительных условиях. Такой набор также называется "гены домашнего хозяйства". Следовательно, минимальный геном должен обеспечивать три фундаментальных условия существования клетки:

1)     Упрощённая система репликации и репарации ДНК (а также налаженная система транскрипции и трансляции для сохранения и корректного использования генетического материала)

2)     Самодостаточный метаболизм, обеспечивающий питание и структурную целостность

3)     Наличие клеточной оболочки, обеспечивающей нормальный метаболизм внутри клетки и обмен веществ между клеткой и окружающей средой как у самого организма, так и у его потомков.

Разработкой и анализом минимальных геномов наиболее известен учёный и венчурный капиталист Крейг Вентер. Наиболее результативная стратегия по поиску минимального генома заключается либо в селекции с постепенным отсечением генов, либо в поиске такого генома у живого микроорганизма, который по каким-то причинам эволюционировал в сторону редукции генома. Как правило, это происходит при переходе организма к паразитическому или мутуалистическому образу жизни. Такие микроорганизмы в основном являются эндосимбионтами, то есть, их жизнь и обмен веществ полностью зависят от хозяина, но и своему хозяину они упрощают и диверсифицируют метаболизм. Эта эволюционная стратегия называется «синдромом редукции генома». В зависимости от длительности такого сосуществования и от конкретного хозяина геном паразита может ограничиваться сотнями тысяч пар оснований. Одним из самых маленьких геномов обладает бактерия Candidatus Hodgkinia cicadicola (эндосимбионт цикады), обходящаяся 144 тысячами пар оснований. Тем не менее, это экстремальные случаи, и в качестве «операционной системы» для свободноживущего организма не подходит. Крейг Вентер взял в качестве модельного организма бактерию Mycoplasma genitalium, в геном которой входит примерно 583 000 пар оснований.       

Синтез генома

В 2008 году геном микоплазмы впервые был химически синтезирован с нуля в институте Вентера. Процесс представлял собой последовательную сборку от олигонуклеотидов до полноценных хромосом. В 2010 году в том же институте на основе генома микоплазмы была создана первая синтетическая клетка.  Эта клетка называется Syn 3.0, она существует в идеальной «экосистеме» и содержит всего 473 гена (против 525 генов) у микоплазмы. Эта клетка нормально растёт, питается и размножается. Входящие в неё гены делятся на следующие функциональные категории:

1)      195 генов регулируют экспрессию: транскрипцию, регуляцию, трансляцию, работу РНК, фолдинг белков, биогенез рибосом, модификацию рРНК (рибосомных РНК) и тРНК (транспортных РНК)

2)      34 гена обеспечивают сохранение генома

3)      84 гена участвуют в поддержании архитектуры клетки

4)      81 ген отвечает за метаболизм

Функция ещё 79 генов пока остаётся невыясненной. 

Сравнение Syn 3.0 и операционной системы

Syn 3.0 оказалась самодостаточной единицей, которая поддаётся встраиванию в эукариотические клетки, например в дрожжи. Таким образом, вслед за синтезом прокариотического генома открываются возможности по перепрограммированию эукариотического генома.

Для реализации стабильных генетических цепочек и пересборки биосинтетических путей требуется переделать весь микроорганизм. При этом необходимо гарантировать, чтобы в ходе такой направленной эволюции организм оставался жизнеспособен, сохранял минимальный набор генов, дополняемый новыми функциональными возможностями (например терапевтическими). В вышеприведённой таблице указано, что прокариоты, в отличие от эукариот, могут подхватывать из окружающей среды плазмиды — наборы генов, предназначенные, например, для подавления антибиотиков.

Приём плазмид — это динамическая интеграция собственного генома с заимствованными компонентами, причём у некоторых бактерий генетический материал в плазмидах может превышать по объёму собственный бактериальный геном. Кроме того, прокариоты неприхотливы по части метаболических путей. Они могут эволюционировать из аэробных форм в анаэробные, а  энергию извлекать из источников, непригодных для питания эукариот. При всех подобных опытах важно минимизировать исходный геном, на котором будут надстраиваться дополнительные функции. Уменьшение и надстройка — это частные  случаи редактирования геномов при помощи технологий CRISPR и Cas9. Подробный разбор этих технологий выходит за рамки поста, на Хабре они хорошо рассмотрены, например, здесь.

ДНК-оригами и ДНК-домино

Наконец, создание минимальных геномов открывает путь к вычислениям на основе нуклеиновых кислот, где ДНК используется в качестве хранилища данных, а РНК — для передачи информации и реализации логических операторов. Такие исследования ведутся в Microsoft с середины 2010-х, причём рекорд по объёму информации, записываемой в ДНК, постоянно обновляется. Одна из наиболее перспективных технологий для таких вычислений — ДНК-оригами, позволяющая не только свёртывать ДНК в компактные фигуры, но и оптимизировать расположение нуклеотидов для быстрого неразрушающего считывания. Чем меньше геном, тем быстрее и надёжнее обеспечивается его масштабирование (амплификация), резервное копирование и версионирование.

В 2017 году специалисты Microsoft и Вашингтонского университета подготовили статью для журнала Nature Nanotechnology, в которой впервые продемонстрировали, как при помощи ДНК-оригами реализовать в ДНК логические вентили AND и OR. Поскольку эти операции объединяются в цепочки, авторы называют свой метод не «ДНК-оригами», а «ДНК-домино».

По-видимому, именно здесь проходит та граница, после которой микроорганизм начинает вести себя как компьютер. В том же 2017 году Александер Грин из Гарварда и его исследовательская группа продемонстрировали сложную вычислительную логику на основе рибосом, собрав первый «рибокомпьютер». РНК в таком наноустройстве начинает работу, только будучи активирована химическим сигналом. Она содержит команды не только для синтеза белков, но и для логических функций. В опытах Грина РНК собирала фосфоресцирующий белок (свечение служило индикатором успешного выполнения программы).   

Грин считает, что такие логические молекулы уже не уступают по сложности первым транзисторам, а значит, из них можно собирать и более сложные схемы. Он говорит о создании специальной «вентильной РНК» (gate RNA), которая может доставляться в клетку в плазмидах. Самая сложная конструкция, которую Грину удалось создать in vitro, включает 5 вентилей AND, 5 вентилей OR и 2 вентиля NOT. Впрочем, в клетке весь генетический материал перемешан, и для исключения «случайных срабатываний» может потребоваться целый новый класс алгоритмов, выполнение которых в клетке должно немедленно прекращаться или откатываться, если что-то пойдёт не так. Важнейшее условие для контроля над такими устройствами — поддержание генома в минимальной необходимой комплектации, которая при этом оставалась бы жизнеспособной и легко воспроизводимой.

Комментарии (14)


  1. shadrap
    31.01.2023 17:39
    +3

    В 2010 году в том же институте на основе генома микоплазмы была создана первая синтетическая клетка.  Эта клетка называется Syn 3.3.0н

    немного на другой основе была создана syn3.0 M. genitalium очень плохо росла (16 часов для дупликации) и ее заменили на микоди хотя ее геном и был больше . не совсем это "чистый" эксперимент, поскольку олигонуклеотидная последовательность имитирующая рекомбинантный геном была просто вставлена в рабочую клетку из которой предварительно весь нативный геном вычистили... к тому же синтез цепочек вели с помощью дрожжей , ибо в 2010 году создавать олигонуклеотидные цепочки такой длины да еще и с достоверной точностью. Это была "адская" работа, куча людей, куча денег, конечно первый синтетический условно рабочий организм, но.... функция 179 удаленных генов так и осталась не выясненной.))


    1. ValeriyPu
      01.02.2023 13:11

      очень плохо росла

      Еще бы, ведь

      функция 179 удаленных генов так и осталась не выясненной

      Что странно, учитывая AlphaFold и прочие методы изучения структуры белков. Да и симуляторов молекулярной динамики\химических реакций хоть отбавляй. Да и кибергенетика(cybergenetics) уже существует.


      1. shadrap
        01.02.2023 15:48

        ну знать конформацию и понимать функции белка это две мега-разные вещи)

        Еще бы, ведь ...

        не, это у нее в природе, медленная она)


        1. ValeriyPu
          02.02.2023 13:28

          ну знать конформацию и понимать функции белка это две мега-разные вещи

          Ну да, binding и участие в различных реакциях уже можно определять дома, с Lattice Microbes.
          У белков функция не формой определена и молекулярным составом среды, а смыслом в белок заложенным?


          1. shadrap
            02.02.2023 14:06

            я не очень знаю что делает Lattice Microbes, это нвидиовский RDME эмулятор? - тогда это не совсем о том.

            имея только ДНК последовательность белка мы не можем точно определить выходной белок по причине (и при условии) не знания транскрипционных факторов и пост- трансляционных факторов, которые могут существенно изменить и комформацию и роль белка в клетке ( например lipidation , что обычно случается с белками - мембранными рецепторами). Конечно можно масс-спектрометрией отловить все белки и попытаться сравнить кто есть кто, но если уровень экспрессии слабый , то это практически не возможно. И скорее всего гены о которых мы говорим очень слабо экспрессирвали и ни РНК ни белки от них не удалось идентифицировать с достоверной точностью.


  1. visirok
    31.01.2023 23:09
    +2

    Очень хорошая статья с глубокой проработкой материала и многочисленными интересными ссылками.

    Но боюсь, поиск в живом организме спрятанных ОС - тупиковый путь. Просто техносфера постоянно подбрасывает идеи, с помощью которых люди пытаются объяснить функционирование живых существ или социальных систем. Аристотель объяснял всё взамодействием горячих и не очень жидкостей. Потом стали искать в организме действие механики. Рычаги нашли, а шестерёнки - нет. Потом пришла пора химии. Потом электрики. Сейчас - информатики.

    А организм только частично использует химические и электрические эффекты. Каждый раз он со своей сложностью «ускользает» из очередной модели.


    1. vassabi
      01.02.2023 10:50

      ничего-ничего, это всего лишь показывает долгий путь.

      люди ведь все лучше и лучше находят объяснения, не так ли ?


    1. bbs12
      01.02.2023 11:11

      А организм только частично использует химические и электрические эффекты.

      Ничего не понял - а что еще он использует? Есть 4 взаимодействия: электричество, сильное, слабое, гравитация. Химия и электричество - это суть одно и то же, электрослабое взаимодействие. Некоторые системы организма (обоняние, мутации в ДНК, энзимы) в теории могут использовать квантовые эффекты, типа туннелирования. В биологии есть какие-то фундаментальные непонятные сущности?


      1. UnknownUser
        01.02.2023 13:20

        Скоро начнем изучать, как организмы используют темную материю


      1. vassabi
        01.02.2023 18:51

        живые организмы могут внутри и квантовые эффекты использовать


      1. visirok
        02.02.2023 01:02

        Вы правы. Я недообьяснил свою мысль.

        На уровне сегодняшнего знания процессов мозга информация в него и внутри него передаётся вроде бы как только с помощью химических и электрических эффектов. Но этого совершенно недостаточно для обьяснения его работы. Непонятно откуда берутся более-менее сложные рефлексы, не говоря уже о более сложных процессах, типа нашей с Вами дискуссии.


  1. DaneSoul
    01.02.2023 10:53
    +1

    Спасибо за интересную статью.
    В таблице есть неточность:

    Митохондрии — есть у животных и грибов
    Митохондрии характерны для большинства эукариот, в том числе для автотрофных растений.


  1. HenryPootle
    01.02.2023 15:56

     При этом прокариоты значительно мельче эукариот, а устройство двух этих разновидностей клеток отличается настолько, что вряд ли существует способ синтезировать эукариота из прокариотов.

    Значит ли это, что эволюция от прокариот к эукариотам невозможна?


    1. vassabi
      01.02.2023 19:04

      ну ... возможна ли эволюция от крокодилов к обезьянам ? (а что? - и те и те хордовые!)