Технология на основе ДНК-штрихкодирования способна легко разметить беспрецедентное количество связей между отдельными клетками мозга. Неожиданная сложность зрительной системы – только первый из обнаруженных ею секретов.

Сидя за столом в своём кабинете на кампусе Лаборатории Колд-Спринг-Харбор, нейробиолог Тони Задор повернул монитор своего компьютера ко мне, чтобы показать сложный график в виде матрицы. Представьте себе электронную таблицу, которая вместо чисел заполнена цветами различных оттенков и градаций. Мимоходом он сказал: «Когда я говорю людям, что разобрался в связях десятков тысяч нейронов и показываю им это, в ответ они просто произносят „А?“ Но когда я показываю людям вот это…» Он нажал на кнопку, и на экране появилась прозрачная трёхмерная модель мозга, вращающаяся вокруг одной из осей, заполненная узлами и линиями, в количестве слишком большом, чтобы их можно было подсчитать. «Они говорят: „Какого … !“

Задор продемонстрировал мне карту 50 000 нейронов в коре головного мозга мыши. На ней было размечено, где находятся тела всех нейронов, и куда они направляют свои длинные ветви аксонов. Нейронных карт такого размера и детализации раньше никогда не было. Задор отказался от традиционного подхода построения карты мозга через флуоресцентную разметку нейронов, и избрал необычную технологию, основанную на давней традиции исследований по молекулярной биологии в Колд-Спринг-Харбор на Лонг-Айленде. Он использовал частицы информации о геноме для внедрения уникальной последовательности РНК, или „штрихкода“, в каждый отдельный нейрон. Затем он рассёк мозг на кубики и скормил их ДНК-секвенсору. В результате получилось трёхмерное изображение 50 000 нейронов коры мозга мыши (а скоро к ним добавится и ещё больше), с разрешением вплоть до отдельных клеток.

Эта работа, magnum opus Задора, пока ещё претерпевает серию уточнений и правок перед публикацией. Но в недавно опубликованной в журнале Nature работе они с коллегами продемонстрировали, что эта техника, известная, как MAPseq (Multiplexed Analysis of Projections by Sequencing – сложносоставной анализ проекций через секвенирование, САПсек), можно использовать для поиска новых типов клеток и закономерностей, ранее неизвестных. В работе также было показано, что этот высокопроизводительный метод разметки составляет серьёзную конкуренцию по точности флуоресцентной технике, являющейся текущим стандартом, но лучше всего работающей только с небольшим количеством нейронов.


Тони Задор

Этот проект родился благодаря неудовлетворённости Задора своей рутинной „основной“ работой в должности нейрофизиолога, как он сухо отзывается о ней. Он изучает влияние слуха на принятие решений у грызунов: как их мозг слышит звуки, обрабатывает аудиоинформацию и определяет поведенческий ответ или действие. Электрофизиологические записи и другие традиционные инструменты, применяемые для решения подобных вопросов, не удовлетворили склонного к математике учёного. Проблема, как говорит Задор, состоит в том, что нам недостаточно хорошо известны нейронные связи, поэтому в качестве „подработки“ он пытается создавать новые инструменты для получения изображений мозга.

Текущее состояние передовых технологий по построению карт мозга – это проект атласа мозга Allen Brain Atlas, собранного в результате нескольких лет работы множества лабораторий, и обошёлся он примерно в $25 млн. Алленовский атлас известен, как атлас массовых связей, поскольку он отслеживает субпопуляции нейронов и их групповых соединений. Он очень пригодился исследователям, но он не способен провести тонкие различия, имеющиеся внутри групп или субпопуляций нейронов.

Если мы когда-нибудь захотим узнать, как мышь слышит высокую трель, обрабатывает её и понимает, что звук означает появление награды в виде освежающего напитка, или формирует новую память, чтобы позже вспомнить об угрозе, нам необходимо начать с карты, или схемы соединений мозга. С точки зрения Задора, недостаток знаний о такого рода соединениях играет свою роль в том, почему прогресс в лечении психиатрических заболеваний идёт так медленно, и почему искусственный интеллект всё ещё недостаточно интеллектуален.

Джастус Кебскул, нейробиолог из Стэнфордского университета, автор новой работы для Nature и бывший аспирант лаборатории Задора, отметил, что заниматься нейробиологией, не зная о соединениях, это всё равно, что „пытаться понять, как работает компьютер, смотря на него снаружи, засовывая в него электрод и пытаясь понять, что там можно найти. Не зная, что жёсткий диск соединён с процессором, а USB передаёт системе входные данные, очень сложно понять, что происходит“.

Вдохновение для разработки САПсек пришло к Задору, когда он узнал о ещё одной технологии построения карты мозга, под названием Брэйнбоу [раскраска нервных клеток флуоресцентными белками в разные цвета; brain – мозг, rainbow – радуга / прим. перев.]. Этот метод, появившийся в лаборатории Джеффа Лихтмана из Гарвардского университета, примечателен тем, что способен генетически разметить до 200 отдельных нейронов одновременно, используя разные комбинации флуоресцентных красок. В результате получилась живописная многоцветная картинка из нейронов неоновых цветов, детально показывавшая сложную смесь из аксонов и тел нейронов. Эта революционная работа давала надежду на то, что разметка коннектома – полного описания всех нервных связей мозга – приближается к реальности. К сожалению, ограничением этой технологии на практике стало то, что при просмотре через микроскоп экспериментаторы могли распознавать от пяти до десяти различных цветов, чего было недостаточно для проникновения в хитросплетения нейронов в коре мозга и разметки множества нейронов одновременно.

Именно тогда в голове Задора зародилась идея. Он понял, что проблему чрезвычайной сложности коннектома можно укротить, если исследователям удастся приспособить для своих нужд увеличивающиеся скорости и уменьшающуюся стоимость технологий высокопродуктивных секвенирования генома. „В математике это называется свести задачу к предыдущей, уже решённой“, — пояснил он.



В САПсек исследователи вводят животному генетически изменённые вирусы, переносящие множество известных последовательностей РНК, или „штрих-кодов“. Порядка недели вирусы размножаются в организме животного, и заполняют каждый нейрон уникальной комбинацией этих штрих-кодов. Когда исследователи после этого разрезают мозг на кусочки, РНК-штрихкоды могут помочь им отслеживать отдельные нейроны от кусочка к кусочку.

Идея Задора привела к появлению новой работы в Nature, в которой его лаборатория и команда из Университетского колледжа в Лондоне под руководством нейробиолога Томаса Мэрсик-Флёгеля использовали САПсек для отслеживания связей почти 600 нейронов в зрительной системе мыши.

600 нейронов – скромный старт по сравнению с десятками миллионов нейронов, содержащихся в мозге мыши. Но этого хватило для определённой цели, которую ставили себе исследователи. Они хотели понять, есть ли в схеме связей мозга структура, которая может пролить свет на его работу. Сейчас популярна теория о том, что в зрительной коре отдельные нейроны собирают отдельные части информации из глаз – по поводу краёв объектов, находящихся в поле зрения, или типе движения, или пространственной ориентации, например. Затем нейрон отправляет сигнал в один соответствующий участок мозга, специализирующийся на обработке информации этого типа.

Пример того, как САПсек может определять связи множества нейронов:


Цветные точки обозначают расположение тел 50 000 нейронов на коре мозга мыши


Связи аксонов всего двух нейронов, заканчивающиеся где-то в других местах мозга


Нервные пути множества нейронов

Для проверки его теории команда сначала разметила несколько нейронов мыши традиционным способом, вводя генетически закодированную флуоресцентную краску в отдельные клетки. Затем они при помощи микроскопа отследили, каким образом клетки протянулись от основной зрительной коры до других участков мозга. Они обнаружили, что аксоны нейронов разветвлялись и отправляли информацию сразу нескольким участкам мозга, что опровергло теорию связей „один к одному“.

Затем они начали искать закономерности этих связей. Они использовали САПсек для отслеживания связей 591 нейрона, разветвлявшихся и иннервировавших разные цели. Команда увидела, что распределение аксонов подчиняется закономерностям: некоторые нейроны всегда простирают аксоны в участки, допустим, A, B и C, и никогда – в участки D или E.

Результаты говорят о том, что зрительная система обладает чрезвычайно сложными связями и что закономерности этих связей гораздо сложнее, чем просто связь „один к одному“. „Зрительные участки высокого уровня не просто получают специально обработанную для них информацию, — сказал Кебскул. Вместо этого многие участки получают одну и ту же информацию, “поэтому их подсчёты могут быть связаны друг с другом».

Тем не менее, тот факт, что определённые клетки имеют связи с определёнными участками, также означает, что в зрительной коре находятся специализированные, ещё не открытые клетки. Кебскул сказал, что эта карта похожа на чертежи, которые позволят исследователям будущего понять, чем занимаются эти клетки. «САПсек позволяет вам построить карту оборудования. Как только мы разберёмся с оборудованием, мы сможем начать работу с программным обеспечением и с процессом расчётов», — сказал он.

Конкурентное преимущество САПсек по скорости и стоимости весьма значительно. Согласно Задору, эта технология должна суметь увеличить свой масштаб до 100 000 нейронов, обрабатывая такой объём за пару недель и всего за $10 000 – это гораздо быстрее традиционных методов разметки и сильно дешевле их.

Такие преимущества сделают задачу разметки и сравнения нервных путей множества мозгов более реальной задачей. Изучение таких состояний, как шизофрения и аутизм, которые, как считаются, возникают из-за отличий в схемах соединений мозга, часто расстраивало учёных, поскольку доступные им инструменты не способны распознавать достаточно много мелких деталей, касающихся нервных связей. Можно представить, что исследователи смогут построить карту этих состояний для мышей и сравнить их с более типичными примерами карт мозга, что подстегнёт новую волну исследований. «Многие психические заболевания происходят из-за проблем на уровне связей», — сказал Хон Куй Зен, исполнительный директор отдела структурированных наук Алленовского института изучения мозга. «Информация о связях подскажет вам, где искать ответы».

Подробная разметка также позволит учёным собрать большое количество нейробиологических данных и искать среди них закономерности, отражающие общие принципы работы мозга. «Тони смотрит на мозг неискажённым взглядом, — сказал Шрикант Чаласани, молекулярный нейробиолог из Института Салка. – Как карта генома человека обеспечила опору для проверки гипотез и поисков закономерностей в последовательностях и работе генов, так и метод Тони может сделать то же самое» для вопросов архитектуры мозга.

Подробная карта генома человека не объяснила мгновенно все загадки работы биологии, но она дала список биомолекулярных «запчастей» и открыла путь для целой плеяды революционных исследований. Точно так же на текущем этапе разработки САПсек не может дать информации по поводу работы или расположения клеток, которые она размечает, или показать, какие клетки общаются друг с другом. Но Задор планирует вскоре добавить такую функциональность. Он также работает совместно с учёными, изучающими различные участки мозга, например, нейронные связи, обеспечивающие обработку страха.

«Думаю, что из всех этих связей можно будет извлечь много идей. Но это, как с геномом — сам по себе он не является чем-то интересным, революционными оказываются те вещи, которые он позволяет делать. Поэтому я нахожусь в таком радостном возбуждении, — сказал Задор. – Я надеюсь, что эта технология обеспечит опору следующему поколению работ в этой области».