Биологи уже много лет пытаются собрать из отдельных молекул систему, похожую на живую клетку. Главная сложность здесь в том, чтобы объединить отдельные реакции в единый работающий цикл. Репликация ДНК, синтез белков, рост мембраны и деление — все это должно происходить внутри замкнутого пространства и повторяться из поколения в поколение.

Раньше получалось только что-то одно: либо репликация ДНК в липидных пузырьках, либо рост мембраны, либо синтез белка. Полноценный цикл долго оставался недостижимым. Недавняя работа группы Кейт Адамалы из Университета Миннесоты вплотную приблизилась к этой цели. Их искусственные клетки — пока простые, но уже способные делиться несколько раз.

Как устроена система

Геном состоит из девяноста тысяч оснований, распределенных по семи кольцевым молекулам ДНК — плазмидам. Такое разделение упрощает сборку и позволяет менять отдельные блоки. В плазмидах закодированы ключевые белки: полимераза Phi29, РНК-полимераза T7, α-гемолизин с метками, несколько аминоацил-тРНК-синтетаз и флуоресцентные маркеры. Рибосомы и большинство факторов трансляции поступают извне в виде готового комплекса PURE.

Мембрану формируют из смеси липидов DOPE, DOPC и холестерина. Липосомы получают экструзией через фильтры с порами около 2 мкм — так пузырьки становятся однородными, диаметром 1–2 мкм. Внутрь помещают плазмиды, ферменты и стартовые молекулы для синтеза белка. Получается полностью определенная химическая система — на старте известно, какие именно вещества и в каких количествах находятся внутри каждого пузырька.

Трансляция у них не полностью автономна. Хотя часть факторов закодирована в геноме, основные рибосомы и многие вспомогательные белки поступают из внешнего PURE-комплекса или клеточного экстракта. Это помогает быстро запустить процесс, но создает зависимость от внешних поставок. Рибосомы со временем разрушаются, и без их пополнения работа замедляется. 

Как происходит рост и обмен вещест­вами

Чтобы пузырьки могли расти, исследователи используют белок α-гемолизин. Он встраивается в мембрану, образует поры и несет метки (His или FLAG), которые помогают взаимодействовать с пузырьками-«кормушками».

Эти пузырьки содержат липиды, дополнительные ферменты и мелкие метаболиты. Когда α-гемолизин на поверхности липосомы связывается с Ni-NTA-липидами, мембраны сливаются. В результате липосома получает новые липиды для своей оболочки и часть содержимого кормушки. Чем больше система синтезирует α-гемолизина, тем эффективнее происходит слияние и тем быстрее растет липосома. Рост напрямую зависит от экспрессии гена α-гемолизина.

При этом слияние происходит не хаотично. Оно зависит от концентрации пузырьков в среде и количества молекул α-гемолизина на поверхности. В условиях нехватки корма выигрывают те липосомы, которые производят больше α-гемолизина: они быстрее растут и раньше делятся. Этот механизм оказался простым и в то же время достаточно эффективным, чтобы поддерживать рост в течение нескольких поколений.

Разделение без цитоскелета

Одна из самых заметных особенностей работы — деление происходит без участия цитоскелета. У бактерий за это отвечают белки вроде FtsZ, которые формируют кольцо и стягивают мембрану. Здесь все устроено проще: встроенный в оболочку α-гемолизин связывает стрептавидин и другие молекулы. Они накапливаются, отталкиваются друг от друга и изгибают мембрану, так что липосома разделяется.

Деление получается не идеально ровным — дочерние пузырьки отличаются по размеру сильнее, чем у настоящих клеток. Но оно работает стабильно и не требует дополнительных генов. В первых экспериментах использовали механическое разделение через фильтр, но потом перешли на генетически управляемый вариант. Теперь успех деления напрямую зависит от активности синтеза поверхностных белков.

Деление запускается только после репликации ДНК и роста липосомы.  Благодаря этому удается сохранить последовательность, близкую к естественному клеточному циклу: репликация — рост — деление.

Полный клеточный цикл пять раз подряд

Чтобы проверить устойчивость всей цепочки, исследователи пропустили одну и ту же популяцию пузырьков через полный цикл пять раз подряд. Каждый включал инкубацию с кормушками (рост и слияние), репликацию ДНК с помощью Phi29, экспрессию белков и разделение. Между циклами кормушки удаляли диализом или фильтрацией, а затем добавляли свежие.

За поколениями следили с помощью коротких РНК-«счетчиков». На каждом цикле добавляли уникальные олигонуклеотиды, которые соединялись только после определенного числа делений. Так определяли, сколько раз поделилась каждая липосома. Также измеряли количество новой ДНК (по устойчивости к DpnI), уровень мРНК и флуоресценцию репортерных белков.

После пяти циклов примерно треть пузырьков сохранила все семь плазмид. У остальных не хватало одной или нескольких молекул — чаще тех, что не критичны для цикла. Плазмиды распределяются случайно, и с каждым делением возрастает риск потерять хотя бы одну. Но сам факт, что система выдержала пять циклов, уже отличает эту работу от предыдущих.

В одном из экспериментов сравнивали две версии гена α-гемолизина — с обычным промотором T7 и с усиленным T7Max. Усиленный вариант давал больше белка, и такие пузырьки быстрее захватывали кормушки. При избытке ресурсов разница была небольшой. Но как только корма стало меньше, преимущество стало очевидным: пузырьки с T7Max получали больше липидов, быстрее росли и давали больше потомков.

Через несколько поколений доля усиленного варианта в популяции выросла. Исследователи не добавляли новых мутаций — просто смешали две группы и дали им соревноваться. Оказалось, что даже в такой упрощенной системе изменение регуляции одного гена дает реальное преимущество в размножении при ограниченных ресурсах. Это первый случай, когда в конструкции, собранной из отдельных молекул, удалось наблюдать нечто похожее на дарвиновский отбор в течение нескольких поколений.

Проблемы и перспективы

Система пока не может работать бесконечно без вмешательства. Одна из главных причин — случайное распределение плазмид. С каждым делением все труднее сохранить полный набор генов.

Следующее ограничение — использование уже существующих природных молекул. Phi29 и T7 — продукты вирусов, прошедших миллиарды лет эволюции. α-гемолизин тоже не примитивный белок. Система показывает, что можно собрать работающий цикл из готовых деталей, но не объясняет, как такое могло возникнуть на ранней Земле.

К тому же конструкция требует активного участия экспериментатора: нужно добавлять кормушки, иногда стрептавидин для запуска деления, контролировать температуру и среду.

Тем не менее, работа дает исследователям платформу для проверки гипотез о минимальных требованиях к живым системам. Следующий шаг — добавлять новые гены и смотреть, как это влияет на устойчивость цикла и распределение генетического материала. Очевидное направление — попытаться собрать рибосомы из компонентов, закодированных в самом геноме. Также предстоит улучшить механизм деления, чтобы уменьшить потерю плазмид и повысить выход полноценных потомков.

Для понимания происхождения жизни важно, что удалось показать: даже без цитоскелета и сложных систем разделения можно добиться нескольких циклов роста и деления, если есть хотя бы примитивный механизм обмена с окружением и генетический контроль.

Что дальше? Исследователи уже основали организацию Biotic, которая хочет сделать такие платформы открытыми и модульными. Идея в том, чтобы разные лаборатории могли использовать одну и ту же базовую конструкцию, постепенно добавляя новые функции — например, более совершенное деление, собственный синтез рибосом или новые механизмы обмена веществами. Это должно ускорить развитие искусственных клеток, поскольку каждый следующий проект не придется собирать заново с нуля.