К сожалению, история нашего вида наполнена множеством трагических событий глобального масштаба: войны, природные катаклизмы, пандемии. Одним из таких событий является пандемия чумы, названная «Черная смерть», забравшая жизни десятков миллионов людей в Европе в период с 1346 по 1353 год. Однако, эти несколько лет являются лишь пиком распространения чумы. Повторные вспышки продолжались вплоть до XIX века. Ученые из Эстонского научного агентства провели масштабное исследование древних ДНК, в ходе которого была установлена хронология распространения, мутации и всплесков чумы протяженностью в 400 лет. Какие данные были использованы в анализе, что именно они показали, и как полученные сведения могут помочь в современной эпидемиологии? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

С момента публикации первого генома Yersinia pestis, реконструированного на основе древней ДНК, палеогеномика стала неотъемлемой частью междисциплинарных исследований чумы. Анализ древних геномов позволил непосредственно подтвердить роль Y. pestis в пандемиях чумы, разрешить ряд существовавших ранее споров и получить новые данные для изучения истории второй пандемии чумы. Особую ценность в этом отношении представляли точно датированные чумные захоронения. В частности, исследования захоронений в Кара-Джигаче (Кыргызстан), где надгробные надписи содержали точные даты, подтвердили, что возникновение Черной смерти и всех известных штаммов второй пандемии произошло в Центральной Азии в начале XIV века. Идентификация многочисленных геномов Y. pestis из различных мест в Германии, Италии, Франции, Норвегии и Испании, относящихся к середине XIV века, как идентичных геномам из лондонского некрополя Ист-Смитфилд (1348–1350 гг.), свидетельствовала о стремительном распространении единой линии Y. pestis в Европе в период Черной смерти (1347–1353 гг.). Наконец, геномы, связанные с Великой чумой в Марселе (1720–1722 гг.) и вспышками чумы во время Тридцатилетней войны (1629–1639 гг.), продемонстрировали появление двух основных клад на позднем этапе второй пандемии.

Тем не менее в большинстве палеогеномных исследований использовались материалы из коллективных и массовых захоронений, датированных лишь приблизительно, или же применялся метод широкомасштабного скрининга человеческих останков. При этом единственной хронологической информацией зачастую служили радиоуглеродные (RC от radiocarbon) датировки с интервалами погрешности до 150 лет. Кроме того, на радиоуглеродные датировки останков людей в той или иной степени влияют эффект смещения возраста, обусловленный особенностями коллагена костной ткани (HBCO от human bone collagen offset), и резервуарный эффект. Подобная временнáя неопределенность затрудняет понимание микроэволюции Y. pestis, и методы молекулярного датирования позволяют лишь отчасти преодолеть эту проблему. Более того, это препятствует выявлению пространственно-временных закономерностей, которые могли бы пролить свет на время и место возникновения новых филогенетических линий. Без точных хронологических данных попытки связать события эволюции патогена с антропогенными или климатическими факторами — как это было сделано для хорошо датированных моментов начала Первой и Второй пандемий — остаются лишь гипотетическими.

Изображение №1

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые представили вновь реконструированные геномы Y. pestis, полученные от 11 индивидов (среднее покрытие от 4.4 до 24.2 раза), а также геномные данные патогена еще по 15 инфицированным чумой индивидам (среднее покрытие от 1.0 до 4.4 раза). Образцы происходят из 11 локаций, расположенных в Эстонии, Нидерландах, западной части России, Швейцарии и Англии, и охватывают период с конца XIV до начала XVIII века (карта выше). Для повышения точности и достоверности имеющихся радиоуглеродных датировок ученые разработали и применили методологический подход — филогенетически обоснованное радиоуглеродное моделирование (PhIRM от Phylogenetically Informed Radiocarbon Modeling), — позволяющий уточнить время захоронения жертв чумы путем интеграции филогенетической информации в байесовское радиоуглеродное моделирование. Полученные уточненные датировки сопоставляются с историческими документами, что позволяет связать секвенированные и проанализированные геномы с конкретными задокументированными вспышками чумы. Данный подход применяется как к новым геномам, реконструированным в рамках настоящего исследования, так и к ранее опубликованным геномам, что дает возможность установить вероятную связь 75 высококачественных геномов Y. pestis периода Второй пандемии с конкретными вспышками заболевания.

Результаты исследования

Концептуальная разработка уточненной филохронологии

К 2026 году благодаря анализу древней ДНК были идентифицированы останки более 140 жертв Второй пандемии из более чем 50 местонахождений, что позволило получить свыше 80 геномов Y. pestis со средним покрытием не менее трехкратного. Эти данные были дополнены рядом оцифрованных и привязанных к географическим координатам массивов информации о документально зафиксированных вспышках чумы, а также историческими реконструкциями вспышек и волн эпидемии, связывающими их с гипотетическими природными резервуарами в различных регионах Евразии. Однако, несмотря на успехи в соответствующих областях исследований, любые попытки сопоставить геномы или клады чумы древних образцов с документальными свидетельствами по-прежнему существенно затруднены неопределенностями, характерными как для палеогеномики, так и для исторических дисциплин.

До настоящего времени при извлечении временной информации из филогении Y. pestis основное внимание уделялось методам молекулярного датирования, хотя их применимость ставилась под сомнение из-за отсутствия временного сигнала в некоторых исследованиях. В труде “Plagued by a cryptic clock: insight and issues fromthe global phylogeny of Yersinia pestis” ученые показали, что временной сигнал для вида в целом нестабилен, однако он существенно усиливается при рассмотрении отдельных субклад. Вместе с тем исследование продемонстрировало, что Y. pestis характеризуется высоким филодинамическим порогом: расчетная скорость нуклеотидных замен соответствует одной замене в интервале от 1.1 до 14.1 года. Этот фактор рассматривается как одна из причин низкой эффективности филогеографического анализа при отслеживании распространения Y. pestis, особенно в период второй пандемии. Единственной попыткой получить временную информацию о филогении второй пандемии иными способами стало перекрестное датирование идентичных геномов, относящихся к периоду европейской Черной смерти.

Изображение №2

В рамках данного исследования ученые предлагают метод (схема выше), направленный на уточнение временных интервалов датировки древних геномов Y. pestis посредством моделирования радиоуглеродных (RC) дат. Этот метод предполагает использование относительной хронологической последовательности, заложенной в филогенетическом дереве, при анализе имеющихся радиоуглеродных и календарных дат, соотнесенных с конкретными геномами. Ранее попытки или предложения использовать ограничения, полученные на основе палеогенетических данных, для моделирования радиоуглеродных дат ограничивались реконструкцией родословных по древней ДНК человека — задачами, сопряженными с принципиально иными проблемами и особенностями интерпретации. Что касается геномов древних патогенов, то моделирование радиоуглеродных дат уже применялось для идентификации доисторических эпидемий чумы, однако в этих случаях за основу бралась совместимость радиоуглеродных дат, а не филогенетические данные. Подход, опирающийся на информацию об относительной хронологии, требует проведения тщательного филогенетического анализа. Это, в свою очередь, позволяет сопоставлять идентичные, но не имеющие точной датировки геномы, а также определять временные параметры для внутренних узлов и ветвей филогенетического дерева. Уточненные интервалы датировки для вновь секвенированных и ранее опубликованных геномов Y. pestis могут быть использованы для углубленного исторического анализа: они позволяют предположительно соотнести каждый геном с исторически зафиксированными вспышками заболевания, а также существенно детализировать представления о филохронологии и филогеографии второй пандемии чумы.

Недавно полученные геномы древней Y. pestis

В рамках данного исследования ученые проанализировали образцы от 117 индивидов (по одному образцу на человека) из 11 локаций на предмет наличия Y. pestis. Такие локации, как Домата/Эмс (Швейцария), Пярну маантеэ, 59 в Таллине, Лехмья-Пылдикюла и Отепя (Эстония), а также Бенет-стрит в Кембридже (Англия) были определены как потенциальные места экстренных захоронений, связанных со вспышками чумы, на основании археологических или документальных данных. В то же время для других объектов, таких как Арнем (Нидерланды), отбор и анализ образцов на наличие патогенов проводились без предварительных предположений о связи с чумой. После скрининга на патогены с помощью программы KrakenUniq, расчета E-значений и картирования на хромосому и плазмиды Y. pestis ученые классифицировали образцы как отрицательные, положительные или условно-положительные. Из них 26 образцов были отобраны для процедуры обогащения (таргетного захвата) последовательностями, специфичными для Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, с использованием РНК-зондов (таблица №1). Для локаций, где было выявлено несколько индивидов с положительным результатом на чуму и имелся однородный временной и археологический контекст, для обогащения отбиралась лишь часть образцов. При этом учитывались средняя глубина покрытия и сложность (разнообразие) последовательностей Y. pestis в данных полногеномного секвенирования (shotgun-данных). За исключением трех индивидов из местонахождения Мялетъярве, для которых обогащению подвергались исходные библиотеки (полученные без обработки UDG), ученые создали новые библиотеки с предварительной обработкой экстрактов ферментом UDG для устранения повреждений, вызванных дезаминированием.

Таблица №1

После этапа обогащения целевых последовательностей для отдельных библиотек было получено от 3989 до 2084944 уникальных прочтений, картируемых на хромосомную референсную последовательность Y. pestis CO92 (при минимальном качестве картирования 37). Для проведения основного филогенетического анализа ученые использовали 11 реконструированных геномов с глубиной покрытия от 4.4 до 24.2 (3B), а также исследовали 10 геномов с низким покрытием для определения их филогенетического положения.

Уточнение данных для филогенетического анализа

Для проведения филогенетического анализа ученые первоначально отобрали 236 современных геномов Y. pestis. Чтобы исключить потенциально проблемные геномы, ученые отфильтровали исходную панель современных образцов по критерию наличия гомопластических мутаций, ассоциированных с чрезмерно длинными терминальными ветвями, и удалили геномы, содержащие 44 и более таких мутаций. Кроме того, они исключили два генома из-за избыточного количества гетерозиготных SNP, а также выявили два случая идентичных геномов и один случай, когда геномы имели одинаковые идентификаторы, но генетически различались.

Геномы древних патогенов, полученные из археологических образцов, особенно склонны к появлению ложноположительных SNP и избыточных гетерозиготных SNP по двум причинам:

• из-за повреждений, вызванных дезаминированием, которые имитируют замены C > T и G > A;

• из-за того, что наличие участков с дезаминированием обычно учитывается путем допуска более высокого уровня несовпадений (например, параметры bwa-aln -n 0.01, -l 16; так называемое мягкое картирование).

С другой стороны, высокий допустимый уровень несовпадений позволяет картировать на референсный геном больше ридов от нецелевых организмов, что приводит к росту числа ложноположительных SNP и гетерозиготных позиций. Полная обработка ферментом UDG позволяет решить обе проблемы: повреждения, вызванные дезаминированием, удаляются ферментативно, а картирование с низким порогом допустимых несовпадений (например, bwa-aln -n 0.1, -l 32; строгое картирование) снижает вероятность ошибочного картирования последовательностей из окружающей среды. Считается, что такое строгое картирование при работе с данными, не прошедшими обработку UDG, вносит смещение в сторону референсного генома — то есть отдает предпочтение ридам, происходящим от современных загрязнителей (что особенно актуально для ДНК человека), и снижает покрытие генома.

Из опубликованных наборов данных по Y. pestis периода второй пандемии 50 получены из библиотек, полностью обработанных UDG (full-UDG), 51 — из библиотек без обработки UDG (non-UDG), демонстрирующих полный спектр деаминирования, а 26 — из библиотек с частичной обработкой UDG (half-UDG). В последних фрагменты ДНК ферментативно расщепляются в месте деаминирования, поэтому характерные признаки повреждения ограничиваются крайними основаниями секвенированных прочтений. 16 геномных наборов данных получены на основе нескольких библиотек с различными вариантами обработки UDG.

Ложноположительные и гетерозиготные SNP, возникающие из-за недостаточно строгих параметров картирования данных из библиотек без обработки UDG, затрудняют филогенетический анализ, поскольку приводят к искусственному удлинению терминальных ветвей и могут снижать разрешающую способность при анализе внутренних ветвей. В связи с этим ученые протестировали восемь различных методов компьютерной (in silico) обработки для 21 набора данных non-UDG (включая вновь полученные геномы MAL003 и MAL004) и 11 наборов данных half-UDG со средней глубиной покрытия не менее 3.5x, а затем сравнили результаты по таким показателям, как количество уникальных (private) SNP, филогенетически информативных позиций и гетерозиготных позиций, а также оценили влияние на филогенетический анализ.

Для данных, не содержащих повреждений типа UDG (non-UDG), два рабочих процесса продемонстрировали значительное сокращение числа синглтонов по сравнению со стандартным методом картирования с мягкими параметрами (bwa-aln -n 0.01, -l 16):

• Rescaling-Remapping (RsRm) — картирование с мягкими параметрами, пересчет показателей повреждения с помощью mapdamage 2 и последующее картирование с жесткими параметрами (bwa-aln -n 0.1, -l 32);

• Rescaling-Trimming (RsTr) — картирование с мягкими параметрами, пересчет показателей повреждения, обрезка оснований с низкими показателями качества и последующее картирование с жесткими параметрами.

Методы RsRm и RsTr также позволили существенно сократить количество гетерозиготных SNP, служащих индикаторами загрязнения образцов ДНК из окружающей среды, не вызвав при этом значительного уменьшения числа выявленных филогенетически информативных позиций и, в частности, филогенетически информативных замен C > T и G > A.

В случае данных, полученных с использованием протокола half-UDG, ученым не удалось выявить существенных различий между разными вариантами обработки, за исключением снижения числа гетерозиготных SNP. Однако методы RsRm и RsTr позволили сократить длину внутренних и концевых ветвей для геномов AMIENS268, LAR27, SQ8723 и MAJ75, описанных в работе “Improving the extraction of ancient Yersinia pestis genomes from the dental pulp”. Исследование остальных общих SNP у LAR27, AMIENS268 и SQ8723 с помощью BLAST-анализа прочтений, охватывающих соответствующие позиции, показывает, что они обусловлены необычно высокой степенью загрязнения образцов окружающей ДНК и не являются настоящими SNP современного генома Y. pestis, за исключением одного SNP, общего для двух последних образцов.

Изображение №3

Поскольку метод RsTr включает дополнительный этап, приводит к более значительной потере данных из-за обрезки концевых нуклеотидов и не демонстрирует убедительных преимуществ по сравнению с RsRm, ученые выбрали последний в качестве оптимального метода как для данных, не подвергавшихся обработке UDG, так и для данных, прошедших частичную обработку UDG. Кроме того, все синглтоны, выявленные после обработки методом RsRm, прошли дополнительную фильтрацию с помощью программы SNPEvaluation, а позиции, имеющие филогенетическое значение и обозначенные как N, были проверены визуально. В результате была получена аннотированная таблица SNP с внесенными вручную исправлениями и построено схематическое филогенетическое дерево (3A). Анализ вновь полученных геномов с низким покрытием проводился по той же схеме.

Разработка подхода к моделированию радиоуглеродных дат с учетом филогенетических данных

Помимо публикации вновь реконструированных геномов Y. pestis, ученые предлагают здесь подход, позволяющий более точно датировать геномы возбудителя древней чумы путем сочетания филогенетического анализа, байесовского моделирования радиоуглеродных дат и исторических свидетельств. Поскольку Y. pestis эволюционирует строго клонально, ее филогения отражает точную относительную хронологическую последовательность. Этот принцип уже неявно использовался ранее — например, при сопоставлении (или проверке связи) чумных захоронений с неточной датировкой с европейской эпидемией Черной смерти (1347–1353 гг.) на основе генетического сходства с геномами, полученными из хорошо датированных захоронений лондонского некрополя Ист-Смитфилд. В данном исследовании ученые, однако, применяют этот подход систематически к целому ряду случаев, охватывающих более 300 лет, используя методы байесовского моделирования.

Чтобы повысить разрешение и точность датировки геномов Yersinia pestis в отсутствие точных документальных сведений о времени захоронения индивидов, ученые разработали подход, основанный на включении относительной хронологии, заложенной в филогенетическое дерево Y. pestis, в байесовскую радиоуглеродную модель. Для этого ученые преобразовали топологию филогенетического дерева в линейную форму, используя специально разработанную грамматику для кодирования идентичных геномов, сестринских клад (или ветвей) с общим предком, а также отношений предок–потомок. Затем геномы были заменены имеющимися радиоуглеродными датировками, а полученная линейная запись — переведена в код программы OxCal, что позволило использовать относительную хронологическую последовательность в качестве ограничений при построении байесовской модели.

В рамках подхода, основанного на моделировании, ученые рассмотрели все радиоуглеродные датировки, опубликованные ранее для геномов Y. pestis периода второй пандемии или полученные в ходе данного исследования, включая датировки останков других индивидов, предположительно захороненных одновременно в том же археологическом контексте (Домат/Эмс, Лондонское кладбище Нью-Черчъярд, Штанс). Для объединения вероятностных распределений, соответствующих одному археологическому контексту или идентичным геномам, ученые использовали метод оценки плотности ядра, поскольку он не требует, чтобы радиоуглеродные датировки относились к одному и тому же объекту, и менее чувствителен к шуму по сравнению с другими методами.

Изображение №4

Ученые исключили радиоуглеродную дату образца G371 (Хорсенс-Тируп, Дания) из основной модели (график выше), поскольку его интервал 2σ (1224–1280 гг.) полностью предшествует появлению ветви 1 (Branch 1), датируемому примерно 1338/1339 гг. Это, вероятно, обусловлено сильным резервуарным эффектом. Для образцов, датируемых временем после ~1650 г., радиоуглеродный метод дает крайне широкие и разбросанные калиброванные даты — даже при использовании методов оценки плотности ядра (KDE от kernel density estimation), — что связано с выходом калибровочной кривой на плато. Подобная картина наблюдается и в данном случае для образцов из Таллина. Поскольку археологический контекст однозначно связывает эти захоронения с местной вспышкой чумы во время Северной войны 1710 года, ученые использовали календарную дату 1710 ± 1 г. для генома PRN001, рассматривая его как наиболее ранний достоверно датированный потомок кластера BED в составе ветви 1A1. Аналогичным образом, в качестве предковой даты для всех остальных геномов ветви 1 ученые использовали 1350 ± 2 г. (время европейской Черной смерти), однако радиоуглеродные даты захоронений из Кара-Джиача и периода европейской Черной смерти были использованы для проверки (валидации) метода PhIRM.

В протестированных моделях использование радиоуглеродных дат без поправки привело к очень низким показателям согласованности: A_model = 29.3 и A_overall = 31.6. При этом семь дат имели показатели согласованности ниже 60 (значения >60 считаются приемлемыми). Это было обусловлено отдельными датами, для которых априорные оценки возраста оказались значительно выше (древнее), чем апостериорные распределения вероятностей. Подобное расхождение может быть вызвано морским резервуарным эффектом, пресноводным резервуарным эффектом и/или эффектом HBCO. Все эти факторы приводят к смещению оценок возраста в сторону более древних значений по сравнению с реальным временем гибели организма. Поскольку для большинства опубликованных радиоуглеродных дат отсутствовали данные, позволяющие рассчитать величину смещения, ученые проверили применение поправок с нормальным (30 ± 20 радиоуглеродных лет) и равномерным (от 0 до 50 радиоуглеродных лет) распределением ко всем имеющимся датам. Для основной модели ученые выбрали поправку с нормальным распределением, так как она обеспечила более высокие показатели согласованности и более информативные апостериорные распределения вероятностей.

Для оценки влияния универсальной поправки и метода PhIRM на радиоуглеродные датировки ученые построили совместные графики апостериорных распределений вероятностей и провели тест Фридмана, а также апостериорный тест Вилкоксона для парных выборок (с поправкой Холма) как для полных диапазонов 2σ (включая разрывы в мультимодальных распределениях), так и для суммы интервалов 2σ (без учета разрывов). Что касается полных диапазонов (тест Фридмана: P = 1.04e-07), то датировки PhIRM демонстрируют значительно меньшую временную протяженность по сравнению с калиброванными RC-датировками с учетом поправки (P = 5.28e-08, медиана разностей = −40.5) и без нее (P = 1.00e-03, медиана разностей = −38). В отношении суммарных интервалов (тест Фридмана: P = 4.28e-14) метод PhIRM показывает значительное сокращение длительности: медиана разностей составляет −34 года (P = 2.38e-08) по сравнению с калиброванными датировками с универсальной поправкой и −15.5 лет (P = 2.80e-02) по сравнению с калиброванными датировками без поправки. Однако калиброванные RC-датировки с учетом поправки демонстрируют значительно более длительные интервалы по сравнению как с датировками PhIRM, так и с индивидуально калиброванными датировками (P = 5.01e-09, медиана разностей = 16.5).

Таким образом, априорные данные, использованные в данном методе моделирования (в форме относительной хронологии), оказались достаточно весомыми, чтобы компенсировать возросшую неопределенность, вызванную введением универсальной поправки. Дальнейшая доработка модели — за счет включения дополнительных геномов или RC-датировок, а также привлечения иных хронологических данных — потенциально может еще больше сократить интервалы датирования по методу PhIRM.

Ученые дополнительно проверили результаты применения своего метода PhIRM на ряде археологических объектов, для которых имелись дополнительные хронологические данные. В рамках отдельной модели вместо календарной даты 1350 ± 2 года они использовали имеющиеся радиоуглеродные датировки для геномов из Кара-Джигача и образцов европейской Черной смерти. Полученные апостериорные распределения вероятностей продемонстрировали более точное соответствие календарным датам (1338/1339 гг. для Кара-Джигача; 1347–1353 гг. для европейской Черной смерти) при минимальных изменениях радиоуглеродных датировок для геномов, относящихся к периоду после Черной смерти, что подтверждает надежность метода PhIRM. Кроме того, основная модель (изображении №4) позволила уточнить апостериорные распределения вероятностей для двух радиоуглеродных датировок из Домат-Эмса, которые изначально казались подозрительно древними. Уточненные данные указывают на местную вспышку чумы в 1629–1631 гг. (период Тридцатилетней войны), что подтверждается как археологическим контекстом, так и филогенетическим положением геномов (изображении №3). Для локации Лондон-Нью-Черчъярд диапазон индивидуально калиброванных дат (1406–1635 гг., общая продолжительность до 217 лет) в основной модели сузился до интервала в 115 лет (1537–1652 гг.). Этот результат согласуется с данными предыдущего моделирования, определившего интервал 1560–1635 гг. (продолжительность 75 лет), в котором использовались поправка на морской резервуарный эффект и данные археологического контекста, а не относительное хронологическое положение геномов.

Поскольку используемый метод демонстрирует высокую эффективность при анализе геномов, имеющих прямых потомков и предков, близких по времени существования, включение в исследование новых геномов возбудителя чумы и соответствующих им датировок позволит уточнить временные интервалы, рассчитанные ранее для уже опубликованных геномов. В иных случаях неопределенность, обусловленная значительным смещением (описываемым нормальным распределением), приводит к расширению интервалов датировки для геномов, расположенных на терминальных ветвях филогенетического дерева. В связи с этим для таких геномов первостепенное значение приобретает соотнесение с археологическим и историческим контекстом.

Сопоставление филохронологических и исторических данных

Ранее опубликованные и оцифрованные массивы данных о зафиксированных в истории вспышках чумы (как региональных, так и трансграничных) зачастую не отвечают современным научным стандартам. Это обусловлено тем, что они опираются на вторичные источники, каталоги или перечни, не содержащие ссылок на первоисточники, а также страдают от неопределенности ретроспективных диагнозов, вызывающих обоснованную критику. Кроме того, всесторонние и детальные исторические исследования нередко сосредоточены на отдельных вспышках или волнах эпидемии, таких как Черная смерть, pestis secunda, чума времен Северной войны или Великая чума в Марселе. Подходы к выявлению предполагаемых природных резервуаров возбудителя второй пандемии варьировались: от анализа пространственных данных в сочетании с климатическим моделированием и статистического анализа данных об окружающей среде до определения видов-резервуаров и особенностей их экологии с опорой на исторические сведения.

Опираясь на уточненное филогенетическое дерево и скорректированные временные интервалы, полученные с помощью инструмента PhIRM, ученые попытались сузить круг потенциальных вспышек чумы, соотносимых с соответствующими геномами Y. pestis, путем сопоставления с историческим контекстом. Это позволило пересмотреть ранее опубликованные оценки возраста для ряда геномов. Для этого ученые собрали и проанализировали обширный массив архивных и исторических источников, содержащих сведения о задокументированных вспышках чумы в Европе и сопредельных регионах, чтобы соотнести с историческим контекстом все 75 геномов, включенных в данный филогенетический анализ. Кроме того, тщательный анализ документально подтвержденных вспышек позволил ученым выдвинуть гипотезы относительно мест и сроков возникновения линий чумы из различных локальных природных очагов. Результаты анализа PhIRM, а также данные об историческом контексте всех включенных в исследование геномов Y. pestis представлены в таблице ниже.

Таблица №2

Черная смерть

Филогенетические анализы (изображение №3) показывают, что ранее опубликованные геномы, связанные с эпидемией Черной смерти в Европе (1347–1353 гг.) и полученные из Барселоны (Испания), Ист-Смитфилда в Лондоне (Англия), Наббурга (Германия) и Рибе (Дания), идентичны новому секвенированному геному BEN001 с улицы Бенет-стрит в Кембридже (Великобритания). В первоначальной публикации геном G.25Bx98 из Рибе связывали с волнами pestis secunda или pestis tertia на основании медианной даты и дерева максимального правдоподобия, полученных методом молекулярного датирования. Однако в ходе повторного анализа ученые не обнаружили общих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генома G.25Bx98 с ветвью 1B (характерной для pestis secunda) или ветвью 1A (характерной для pestis tertia и последующих вспышек). Единственный выявленный SNP не прошел процедуру фильтрации, что позволило классифицировать этот геном как идентичный другим геномам Черной смерти, включая G.16 и G.25A из того же местонахождения (Рибе, Дания). Ранее были выявлены и другие идентичные геномы — из Осло (Норвегия), Аббадия-Сан-Сальваторе (Италия), а также из Сен-Лоран-де-ла-Кабрерисс и Тулузы (Франция). Однако в данном исследовании они были исключены из рассмотрения из-за наличия ложноположительных SNP.

Судя по данным геномного анализа с низким покрытием, еще один геном с улицы Бенет-стрит (BEN002) и геном COM042 (полученный из захоронения при церкви Олл-Сэйнтс-бай-зе-Касл в Кембридже) также идентичны вышеупомянутым геномам. С учетом ранее опубликованного генома с низким покрытием (NMS003) из монастыря в Кембридже, ученые располагают данными о трех местах захоронения жертв Черной смерти в средневековом Кембридже: это одиночные захоронения на обычных кладбищах (при монастыре и при церкви Олл-Сэйнтс-бай-зе-Касл) и массовое захоронение (на улице Бенет-стрит).

Базальные клады ветви 1A

Недавно секвенированный геном OTE001 (из Отепя, Эстония) представляет собой самый древний из обнаруженных на сегодняшний день в Балтийском регионе геномов периода второй пандемии. Он датируется второй половиной XIV века. Этот геном имеет общую короткую ветвь с геномом COL001 (Коллальто-Сабино, Италия; ранее связывавшимся с pestis secunda). Обе эти линии происходят из точки трифуркации (узел N04) вместе с кладой MAN008/X3003 (Манхинг-Пихль, Германия; Сейет-Эдекиркегорд, Дания) и всеми остальными геномами ветви 1A — уже после отделения линии pestis secunda 1356–1366 годов, относящейся к базальной части ветви 1B.

Клады COL001/OTE001 и MAN008.A/X3003, вероятнее всего, связаны со следующими друг за другом волнами чумы, получившими названия pestis tertia (1362–1379 гг.) и pestis quarta (1378/1379–1389 гг.), хотя установить точную связь в настоящее время не представляется возможным. Примечательно, что геном X3003 (Сейет, Дания) свидетельствует о том, что одна из этих клад, по-видимому, сохранялась как минимум до конца XV века. Кроме того, если происхождение pestis secunda можно проследить до предполагаемого природного (сильватического) резервуара на территории современной Германии (возможно, в южном Гессене), то последующие волны, терзавшие Европу в период от pestis tertia (начавшейся в 1362 г.) до середины XV века, по-видимому, были связаны с иными резервуарами: один из них находился дальше на юго-запад (возможно, на землях Франконии или Швабии), а другой — предположительно где-то в районе Боденского озера или Аппенцелля.

На участке между узлом N04 и малой политомией N16 базальная ветвь 1A характеризуется последовательным выделением более мелких клад. Первая клада, ветвь 1A4, включает геном AHM011 и, предположительно, геном AHM001 (полученный с низким покрытием) из того же местонахождения. AHM011 соответствует узлу N08 и, следовательно, является прямым предком недавно секвенированного образца MAL003 из Мялетъярве (Эстония), а также образца A1480x1480 (Хорсенс, Дания). Благодаря методу PhIRM и анализу исторического контекста ученым удалось сузить круг вспышек, потенциально связанных с AHM011, до событий 1398, 1410–1412 и 1420–1421 годов в Нидерландах. Эти вспышки, в свою очередь, начались соответственно в 1393 или 1395 году (Франкония/Швабия или Аппенцелль/Бодензее), в 1405 или 1407 году (Франкония/Швабия или Аппенцелль/Бодензее) и в 1418 году (Аппенцелль/Бодензее). Данные волны достигли Дании в 1396 году, возможно, около 1413 года и в 1420 году, а Эстонии — в 1404 и 1420 (или 1425) годах.

Вслед за ветвью 1A4 наблюдается появление предположительно короткоживущих ветвей, включающих образец STA001 (Штарнберг, Германия), недавно секвенированные геномы CLP015/CLP017 (Клоптон, графство Кембриджшир, Великобритания) и кластер G701. Два идентичных генома из Клоптона (покинутого средневекового поселения в Кембриджшире) образуют отдельную короткую ветвь. Хотя геном G701 (Рига, Латвия), для которого не была установлена точная датировка, в первоначальной публикации ошибочно относили к периоду 1550–1650 гг., ученые выявили три идентичных генома из Виборга и Хорсенса (Дания), образующих терминальную ветвь (при этом в исходной публикации два генома из Хорсенса — G371 и A146x3011 — описывались как различные). На основании анализа PhIRM и сопоставления с историческим контекстом ученые связывают этот кластер с одной из вспышек, происходивших в 1451–1464 гг., что предполагает более позднюю датировку по сравнению с той, что ранее приписывалась геномам из Хорсенса. Это самый ранний в хронологическом отношении случай обнаружения идентичных геномов в разных географических пунктах после периода Черной смерти, что, по-видимому, свидетельствует о быстром распространении эпидемии.

Ветвь 1A3 и малая политомия

Для второй половины XV века ученые реконструировали возникновение трех крупных клад, появившихся в течение короткого промежутка времени и существовавших как минимум столетие. К ним относятся ветви 1A1 и 1A2, отделившиеся от малой политомии (узел N16) параллельно двум коротким ветвям, а также ветвь 1A3, отделившаяся на одну SNP-мутацию раньше узла N13 — то есть незадолго до малой политомии, примерно в период между 1440 и 1460 годами. В настоящее время филогеографию и историю ветви 1A3 трудно реконструировать из-за малого числа доступных геномов: MAL004 — второй недавно реконструированный геном из Мялетъярве (Эстония), датируемый концом XVI века; NMS002 — образец из захоронения в монастыре в Кембридже (Великобритания), датируемый второй половиной XV или первой третью XVI века; и G488 — образец из братской могилы на кладбище церкви Святой Гертруды в Риге (Латвия), предположительно связанный с локальной вспышкой 1602 года, как было предложено в первоначальной публикации. Монофилия этой ветви дополнительно подтверждается делецией гена inv, и эта же делеция обнаружена у образцов G488 и MAL004.

Точные временные рамки малой политомии остаются неясными, однако их можно ограничить периодом примерно с 1450 по 1500 год; этот период совпадает с великой засухой эпохи Возрождения (Great Renaissance Drought) — суровым климатическим кризисом в Центральной Европе. Ранее уже обсуждалась роль климатических аномалий как факторов, способствующих пандемиям чумы — в частности, Юстиниановой чумы, Черной смерти и последующих вспышек в рамках второй пандемии. Однако точная взаимосвязь между великой засухой эпохи Возрождения и малой политомией еще требует изучения. Помимо основных клад (ветвей 1A1 и 1A2), малая политомия дала начало геному ELW098.A (Элльванген, Германия) и кластеру AGU025.B, представленному одноименным геномом из Вильнюса (Литва) и двумя геномами из Рибе (G207, G.861x1035; Дания). Последние, вероятнее всего, относятся к одной вспышке, произошедшей в период между 1474 и 1507 годами.

Ветвь 1A2

Ветвь 1A2 включает ранее секвенированные геномы из Ландсберга (Германия), Виборга (Дания), Штанса (Швейцария), а также кластер геномов, которые на основании контекстных археологических и исторических данных связывают с чумой времен Тридцатилетней войны (1618–1648 гг.). Хронологические и географические границы ветви 1A2 и соответствующих ей вспышек чумы реконструировать проще благодаря наличию точно датированных геномов ветвей 1A2a и 1A2b. Сопоставив результаты анализа PhIRM с контекстными данными, ученые смогли отнести наиболее древнего представителя этой ветви (геном LBG002.A; Ландсберг-ам-Лех, Германия) к вспышке, произошедшей в период между 1509 и 1520 годами и, вероятно, возникшей в природном очаге в Центральной Европе. За этим геномом следует GrGCx15 (Виборг, Дания), представляющий узел N27 и являющийся прямым предком клады STN и возбудителя чумы времен Тридцатилетней войны. Прямое датирование образца GrGCx15 не проводилось, однако молекулярное датирование, выполненное в первоначальной публикации, определило доверительный интервал 1550–1649 гг. Тем не менее на основании интервалов PhIRM для его предка LBG002.A и потомков, а также исторических данных, наиболее вероятным представляется один из многочисленных случаев вспышек заболевания в период между 1527 и 1568 годами. Если кластер STN (Станс, Швейцария) можно связать со вспышками 1548, 1564–1565 или 1575 годов, то геномы возбудителя чумы времен Тридцатилетней войны довольно точно датируются периодом вспышек 1629–1639 годов. При этом они демонстрируют значительное микроразнообразие, образуя две подклады.

Два недавно реконструированных, различающихся генома (EMS001 и EMS010) из Домат-Эмса (Швейцария) вместе с геномом из Бранденбурга-на-Хафеле (BRA001.A) образуют подкладу 1A2a. Они характеризуются короткими терминальными ветвями, отделяющимися от точки трифуркации и отличающимися одной или двумя однонуклеотидными заменами. Сестринская клада 1A2b включает геномы из Сан-Проколо-а-Натурно (SPN19; Италия), а также из Лари, Амьена и Бове (кластер LAR, AMIENS268, SQ8734; Франция) (5–7). Их филогеографическое перекрытие в Альпийском регионе можно объяснить перемещением войск, заносивших чуму из австрийских (Бранденбург-на-Хафеле и Домат-Эмс) и французских (Лари и Натурно) очагов.

Ветвь 1A1

В ходе филогенетического анализа ученые установили идентичность ранее опубликованных геномов Gdansk8 (Гданьск, Польша), AGU007/AGU010 (Вильнюс, Литва) и генома Rostov2039 (Ростов-на-Дону, Россия). Кроме того, недавно секвенированный геном Stankeyevo (Псковская область, Россия; образец RUS004) и, предположительно, геном RUS003, полученный с низким покрытием, свидетельствуют о присутствии того же штамма в еще одном населенном пункте сельской местности России. Поскольку это уже третий случай обнаружения идентичных геномов в географически удаленных друг от друга местах в период после Черной смерти, ученые связывают эти геномы (далее именуемые кластером базальной ветви 1A1) с эпидемией, имевшей место в период между 1464 и 1515 годами. Хотя убедительные палеогеномные данные пока ограничиваются регионом Балтики, исторический контекст позволяет предположить, что эти геномы связаны с волной эпидемии, затронувшей и другие части Европы.

Кластер BED (Лондон, кладбище New Churchyard, Великобритания) является непосредственным потомком базального кластера ветви 1A1 и характеризуется значительной длиной ветви, составляющей 46 SNP. Этот кластер, в свою очередь, служит предком для остальных геномов ветви 1A1, относящихся к XVIII веку: геномов из Азова, Ростова-на-Дону и Майста (образцы Azov38, Rostov2033, CHE1 из региона Большого Кавказа, Россия); геномов периода Великой чумы в Марселе (кластер OBS, 1720–1722 гг., Франция); а также геномов периода чумы времен Северной войны (1702–1712 гг.), представленных недавно секвенированным геномом PRN001 из Таллина (Эстония) и ранее опубликованным геномом PEB10 из Пестбаккена (Швеция), который происходит непосредственно от PRN001. Дополнительные геномы с низким покрытием, полученные из того же места в Таллине (PRN004, PRN005, PRN008, PRN009) и из Лехмья (LHP001, Эстония), демонстрируют тесное родство или идентичность с геномом PRN001. Оба археологических комплекса могут быть связаны с осадой Таллина в 1710 году и сопутствующей вспышкой чумы: захоронения в Таллине содержат останки шведских и российских солдат, а также мирных жителей, тогда как захоронения в Лехмья идентифицированы как останки российских солдат, дислоцированных за пределами города.

Кластер BED можно связать со вспышкой, имевшей место в период между 1574 и 1636 годами и, вероятнее всего, занесенной из Османской империи. Это указывает на временной разрыв продолжительностью от 60 до 152 лет между базальным кластером ветви 1A и кластером BED. Более поздние штаммы были занесены либо непосредственно с территории Османской империи (через Черное море или Кавказ или через Средиземное море), либо через Юго-Восточную и Восточную Европу в регион Балтики. Таким образом, ученые полагают, что уже лондонский кластер BED представляет собой результат заноса инфекции из Османской империи.

Временной разрыв между базальным кластером Branch 1A1 и кластером BED совпадает с большой геномной делецией, а также с увеличенной скоростью замещения в этой внутренней ветви. Хотя связь между этими тремя наблюдениями пока остается чисто гипотетической, она может быть связана с заносом Y. pestis в другую экологическую нишу в Османской империи, откуда он неоднократно распространялся, по крайней мере, до конца 18 века. Почти идентичная делеция наблюдалась во время более поздней Первой пандемии, одновременно с локализацией в Восточном Средиземноморье.

Смешанные инфекции, вызванные трепонемами

Помимо Y. pestis, у индивида PRN008 была выявлена также инфекция Treponema pallidum. Из-за низкого покрытия генома попыток более детальной характеристики штамма (как T. pallidum pallidum — возбудителя венерического сифилиса, или T. pallidum pertenue — возбудителя фрамбезии) не предпринималось, однако возможность ошибочной идентификации T. denticola была исключена. Ученые представили здесь второй известный случай сочетанной инфекции чумы и трепонематоза, выявленный на основе анализа древней ДНК. Ранее сообщалось о смешанной инфекции с участием T. pallidum pertenue у индивида AGU007 из Вильнюса (Литва), жившего во второй половине XV века. Хотя вопрос о том, присутствовала ли T. pallidum в Европе до или только после Колумбова обмена, остается открытым, недавние исследования прослеживают эволюционную историю и диверсификацию этого патогена в Америке вплоть до периода около 3500 г. до н. э., что согласуется с «колумбовой гипотезой» и данными недавней переоценки возраста образца AGU007 (1453–1497 гг. по байесовскому моделированию радиоуглеродных дат или 1455–1498 гг. н. э. по методу молекулярного датирования). Если исходить из предположения, что все штаммы T. pallidum были занесены в Европу уже после Колумбова обмена, то 1493 год можно рассматривать как наиболее раннюю возможную дату появления базальной ветви 1A1. Это, в свою очередь, сдвигает наиболее раннюю возможную дату возникновения малой политомии ближе к последней четверти XV века.

Известно, что T. pallidum крайне трудно обнаружить, даже у пациентов, находящихся в латентной стадии заболевания. На сегодняшний день большинство древних геномов этого возбудителя было получено из костных останков с характерными поражениями, которые часто классифицируют как случаи врожденного трепонематоза. В связи с этим особого внимания заслуживает обнаружение данного патогена в зубах взрослых людей — явление, которое, предположительно, обусловлено его размножением в кровотоке. Не исключено, что Y. pestis способна создавать благоприятные условия для размножения других бактерий в организме хозяина, тем самым облегчая их выявление в ходе метагеномного скрининга. Подобный сценарий уже рассматривался ранее на примере случая коинфекции Y. pestis и Haemophilus influenzae у англосаксонского ребенка, жившего в эпоху первой пандемии.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Катастрофическая волна чумы, прокатившаяся по Европе в 1347–1353 годах и унесшая жизни миллионов людей получила весьма яркое название — Черная смерть. Однако после этой первоначальной катастрофы болезнь не исчезла. На протяжении еще более четырех столетий чума неоднократно возвращалась.

В рассмотренном нами сегодня труде ученые провели самое подробное на данный момент исследование хронологии событий, связывая как исторические данные, так и генетическую информацию. Анализируя ДНК бактерии чумы, сохранившуюся в археологических человеческих останках, ученые смогли реконструировать распространение и эволюцию возбудителя и установить, что чума неоднократно появлялась в разных регионах Европы спустя много веков после Черной смерти.

Ученые реконструировали 26 геномов бактерии Yersinia pestis по человеческим останкам, обнаруженным на 11 археологических объектах в Эстонии, России, Англии, Нидерландах и Швейцарии. Образцы относятся к XIV–XVIII векам и охватывают значительную часть Второй пандемии чумы.

Генетические данные свидетельствуют о том, что чума не сохранялась в одном регионе, откуда затем неоднократно распространялась в другие места. Напротив, возбудитель, по-видимому, вновь появлялся в разных частях Европы на протяжении нескольких столетий. Это могло приводить к формированию нескольких природных резервуаров, в которых Yersinia pestis могла сохраняться.

Эстония неоднократно подвергалась воздействию чумы. Ученые обнаружили свидетельства того, что возбудитель многократно проникал в этот регион на протяжении значительной части Второй пандемии, что указывает на роль связей Эстонии с другими частями Европы в распространении инфекции на большие расстояния. Особенно характерная картина наблюдалась примерно в 1450–1500 годах. В этот период линии чумы значительно расширились и разделились на три крупные ветви. Они могли способствовать формированию новых природных резервуаров Yersinia pestis в популяциях диких грызунов. На это расширение мог повлиять и климат. Ученые рассматривают Великую засуху эпохи Возрождения как один из возможных факторов. Исследования современных природных очагов чумы показывают, что климатические изменения способны существенно влиять на вспышки инфекции среди диких грызунов, являющихся естественными хозяевами бактерии. Ученые обнаружили свидетельства неоднократного заноса чумы в Эстонию уже с конца XIV века, а также выявили несколько ранее неизвестных генетических линий возбудителя как в городских, так и в сельских поселениях.

Одной из главных проблем при изучении исторических пандемий является определение точного времени возникновения древних инфекций. Во время пандемии COVID-19 ученые могли подробно отслеживать распространение отдельных вариантов вируса, поскольку последовательности их геномов обычно были связаны с точными датами. Древние образцы редко обладают такой привязкой: археологические останки часто датируют радиоуглеродным методом, который может давать интервалы продолжительностью в несколько десятилетий или даже более века. Чтобы решить эту проблему, ученые разработали методику, позволяющую сужать широкие интервалы датировки. Они анализировали положение отдельных геномов чумы на эволюционном дереве бактерии и использовали эту информацию для уточнения вероятных дат появления многих образцов. Это позволило расположить древние инфекции на значительно более точной исторической временной шкале. Затем ученые применили новый подход к 64 ранее опубликованным геномам чумы и 11 вновь секвенированным геномам. Это стало первой систематической попыткой сопоставить практически все доступные геномы чумы XIV–XVIII веков со вспышками, описанными в исторических источниках. Уточнение датировки многих образцов позволило связать их с конкретными волнами распространения чумы и вспышками, зафиксированными хронистами в соответствующих городах и регионах.

Генетические данные также демонстрируют, насколько сильно распространение чумы зависело от деятельности людей. Недавно проанализированные геномы дают дополнительные свидетельства связи отдельных вспышек с Тридцатилетней войной (1618–1648) и Великой Северной войной (ок. 1700–1721). Армии, перемещавшиеся мирные жители, беженцы и торговцы часто пользовались одними и теми же маршрутами, создавая условия для распространения инфекции между регионами. Ученые обнаружили, что в периоды военных конфликтов Yersinia pestis разделялась на новые генетические ветви, а затем распространялась по маршрутам, которыми пользовались войска и перемещенное население. Полученные данные также позволяют подробнее проследить вспышки чумы, связанные с Великой Северной войной. Например, во время осады Таллина в 1710 году болезнь унесла жизни шведских и русских солдат, а также мирных жителей.

В совокупности эти данные показывают, что чума была не только одной средневековой катастрофой. На протяжении многих поколений она оставалась повторяющейся угрозой и неоднократно возвращалась в различные европейские сообщества.

Сегодня чума уже не представляет серьезной угрозы для общественного здравоохранения Европы, однако Yersinia pestis не исчезла. Бактерия по-прежнему сохраняется в природных резервуарах среди грызунов в нескольких регионах мира. Изучение того, каким образом чума закрепилась после Черной смерти, сохранялась на протяжении столетий и в конечном итоге исчезла из Европы, может помочь ученым лучше понять долгосрочное поведение инфекционных заболеваний. Сопоставление древних геномов с зарегистрированными вспышками и предполагаемыми животными резервуарами позволяет проследить, как инфекционные заболевания возникают, распространяются, закрепляются и сохраняются в течение длительных периодов. Эти сведения также могут способствовать совершенствованию современного эпидемиологического надзора и мониторинга регионов, где чума продолжает циркулировать.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?