Что полезно, а что вредно? Извечный вопрос, поражающий массу споров. Кто-то считает, что нужно полностью исключить сладкое, кто-то уверен в полезности рыбьего жира, а кто-то уверен, что вгрызаться в сырой кусок мяса как-то поможет с тестостероном, но таких персонажей лучше обходить стороной. Суть в том, что любое вещество может быть и полезным, и вредным. А вот каким именно, вспоминая слова Парацельса, зависит от дозы. Кофе, а точнее кофеин, который есть и в других напитках и продуктах питания, часто относят к чему-то более вредному, нежели полезному. Однако ученые из Лондонского университета королевы Марии (Великобритания) провели исследование, в котором установили связь кофеина с активацией древних систем клеточного энергообмена, участвующих в процессах стрессоустойчивости, восстановления ДНК и роста. Что это за древние системы, как именно кофеин на их влияет, и появляется ли теперь у кофеманов научно-обоснованная причина любить кофе еще больше? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Кофеин — широко потребляемое нейроактивное соединение из группы метилксантинов — связывают с увеличением хронологической продолжительности жизни (CLS от chronological lifespan), защитным действием против таких заболеваний, как рак, и повышением эффективности клинической терапии. Особый интерес представляет выяснение механизмов, с помощью которых кофеин подавляет сигнальные пути контрольных точек клеточного цикла, реагирующих на повреждение ДНК. Несмотря на то что это соединение активно изучалось на протяжении последних трех десятилетий, точные механизмы влияния кофеина на регуляцию клеточного цикла до сих пор остаются неясными.

Эукариотические клетки постоянно подвергаются повреждениям ДНК, возникающим как в результате метаболических процессов, так и под воздействием факторов окружающей среды, таких как ионизирующее и ультрафиолетовое излучение, табачный дым или химиотерапевтические препараты. У дрожжей Schizosaccharomyces pombe белок Rad3 — серин/треониновая киназа семейства PIKK (киназ, родственных фосфатидилинозитол-3-киназе), гомолог млекопитающих ATM (киназы, мутирующей при атаксии-телеангиэктазии) и ATR (киназы, родственной ATM), — активируется в ответ на повреждение ДНК или репликативный стресс. Активация и фосфорилирование Rad3 создают сайты связывания для адаптерных белков, способствующих активации нижележащих киназ Cds1 и Chk1 в S- и G2-фазах клеточного цикла соответственно. В S-фазе Cds1 фосфорилирует остатки серина и треонина в белке Cdc25, что приводит к его активации и секвестрации в цитоплазме после связывания с белком Rad24 (гомологом белков семейства 14-3-3). Кроме того, в S-фазе Rad3 и Cds1 активируют киназу Mik1, которая напрямую ингибирует Cdc2. У S. pombe время наступления митоза определяется балансом активности фосфатазы Cdc25 и киназы Wee1, регулирующих активность Cdc2. Помимо этого, внешние сигналы, такие как дефицит питательных веществ и стрессовые воздействия, могут влиять на сроки митоза через сигнальный путь комплекса TORC1 (от rapamycin complex 1, т. е. мишень рапамицина комплекса 1). Ингибирование активности TORC1 приводит к активации киназ Ppk18 и Cek1, родственных киназе Greatwall. Ppk18 и Cek1, в свою очередь, активируют эндосульфин Igo1, который ингибирует фосфатазу PP2Apab1 (где Pab1 — регуляторная субъединица у S. pombe), тем самым инициируя митоз.

Первоначальные исследования указывали на то, что кофеин ингибирует Rad3 и его гомологи, тем самым отменяя передачу сигналов контрольной точки клеточного цикла, реагирующей на повреждение ДНК, как в клетках дрожжей, так и в клетках млекопитающих. Эти данные, основанные на экспериментах in vitro, демонстрирующих способность кофеина ингибировать Rad3 и ATM, впоследствии были поставлены под сомнение. Во-первых, было показано, что кофеин способен отменять передачу сигналов контрольной точки при повреждении ДНК, не блокируя при этом сигнальные пути ATM и Rad3. Кроме того, кофеин может ингибировать и другие белки семейства PIKK. Более поздние исследования свидетельствуют о том, что кофеин ингибирует передачу сигналов TORC1 в клетках дрожжей и млекопитающих. Действительно, ингибирования TORC1 у S. pombe достаточно для отмены передачи сигналов контрольной точки при повреждении ДНК. Остается неясным, ингибирует ли кофеин TORC1 напрямую, выступая в качестве слабого конкурента АТФ (ATP от adenosine triphosphate, т. е. аденозинтрифосфат), или же действует опосредованно — через Ssp2 (АМФ-активируемую протеинкиназу, или AMPK от AMP-Activated Protein Kinase, у S. pombe). В связи с этим также неясно, активирует ли кофеин AMPK/Ssp2 (и, как следствие, ингибирует передачу сигналов TORC1) опосредованно, путем запуска пути ответа на стресс. Также было показано, что кофеин увеличивает хронологическую продолжительность жизни (CLS) у S. pombe и в сочетании с рапамицином индуцирует паттерны экспрессии генов, характерные для клеток, испытывающих азотное голодание, или для клеток с условной делецией tor2 (осуществляемой с помощью температурочувствительной (ts) мутации). Мутанты с отсутствующим ssp2 характеризуются сокращенной CLS. Остается неясным, изменяет ли кофеин экспрессию генов и увеличивает CLS непосредственно или посредством активации Ssp2.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые выявили новые функции киназ Ssp1 и Ssp2, обеспечивающих опосредованное ингибирование TORC1 кофеином. Кофеин не мог подавить сигнальные механизмы контрольных точек, реагирующих на повреждение ДНК, у мутантов ssp1Δ и ssp2Δ. Ученые показали, что кофеин взаимодействует с сигнальным путем Ssp1 и индуцирует фосфорилирование Ssp2 зависимым от Ssp1 образом. Кроме того, ученые выявили специфическую роль Amk2, β-регуляторной субъединицы комплекса AMPK, в обеспечении устойчивости к кофеину, возможно, посредством модуляции ремоделирования хроматина и репарации повреждений ДНК. Ниже TORC1 кофеин индуцировал митоз у мутантов ppk18Δ и cek1Δ ppk18Δ, но не у мутантов igo1Δ, однако эта активность не коррелировала с его влиянием на чувствительность к повреждению ДНК. Таким образом, кофеин может повышать чувствительность к повреждению ДНК независимо от митоза, нарушая репарацию повреждений ДНК. Ингибирование TORC1 с помощью торина-1 также значительно повышало чувствительность мутантов ppk18Δ, cek1Δ ppk18Δ и igo1Δ к повреждению ДНК. Эти наблюдения указывают на возможное участие Ppk18, родственной киназы Cek1 и еще одной, пока неизвестной киназы в репарации повреждений ДНК и/или восстановлении после срабатывания контрольных точек. Кроме того, в этом процессе, вероятно, участвует и Igo1, хотя его конкретная роль пока не установлена. Воздействие кофеина также подавляло экспрессию Sck2. Sck2 действует ниже TORC1 и регулирует время наступления митоза, а также участвует в регуляции CLS. Ранее ученые показали, что кофеин увеличивает CLS у S. pombe. Тем не менее оставалось неясным, обусловлено ли это прямым ингибированием TORC1 или индукцией стрессового ответа. В настоящем исследовании ученые показали, что увеличение CLS под действием кофеина зависит от Ssp1, Ssp2 и Amk2. В совокупности эти результаты свидетельствуют о наличии сигнальной оси Ssp1–AMPK–TORC1, опосредующей влияние кофеина как на прогрессию клеточного цикла, так и на хронологическое старение у S. Pombe.

Результаты исследования

Белки Ssp1 и Ssp2 у S. pombe опосредуют влияние кофеина на контрольную точку G2, реагирующую на повреждение ДНК

Изображение №1

Как сообщалось ранее, и кофеин (10 мМ), и торин-1 (5 мкМ) отменяют остановку клеточного цикла, вызванную флеомицином (5 мкг/мл) в клетках S. pombe дикого типа (wt от wild type). Напротив, клетки, подвергнутые воздействию флеомицина или не получавшие обработки, оставались в состоянии остановки деления, тогда как контрольные культуры продолжали пролиферировать со стабильной кинетикой (1A). Ученые предположили, что кофеин отменяет сигнальный путь контрольной точки повреждения ДНК, по крайней мере частично, за счет ингибирования активности TORC1. Прямое ингибирование активности TORC1 с помощью торина-1 оказывается более эффективным, чем воздействие кофеина, что допускает возможность косвенного действия последнего. В связи с этим была рассмотрена роль AMPK и исследовано возможное участие белков Ssp1 и Ssp2 в модуляции митотических эффектов кофеина.

Дефицит питательных веществ или воздействие стрессовых факторов окружающей среды косвенно ингибируют активность TORC1 через активацию пути Ssp1–Ssp2 (каталитическая (α) субъединица AMPK). Делеция генов ssp1 или ssp2 блокировала эффект кофеина, направленный на отмену остановки клеточного цикла, вызванной повреждением ДНК (флеомицином) (1B, 1C). Напротив, эффект торина-1 в аналогичных условиях был лишь частично подавлен (или ослаблен), но не блокирован полностью вплоть до 120-й минуты. Ингибирование TORC1 приводит к активации Ppk18 — гомолога киназы Greatwall, — которая, в свою очередь, активирует белок Igo1. Igo1 ингибирует активность фосфатазы PP2A-Pab1, что заставляет клетки преждевременно вступать в митоз при уменьшенных размерах. Делеция гена ppk18 не подавляла способность ни кофеина, ни торина-1 отменять действие контрольных точек, реагирующих на повреждение ДНК. Однако у мутантного штамма ppk18Δ максимальный уровень септации достигался медленнее, чем у клеток дикого типа (wt) при воздействии блеомицина в сочетании с кофеином или торином-1 (90 минут против 60 минут для штаммов ppk18Δ и wt соответственно; 1D). Примечательно, что одновременное отсутствие генов cek1 и ppk18 (регулирующих igo1) подавляло эффекты торина-1, но не кофеина, в отношении остановки клеточного цикла, вызванной блеомицином (1E). Напротив, делеция гена igo1 существенно снижала способность как кофеина, так и торина-1 преодолевать сигнальный ответ контрольной точки повреждения ДНК (1F).

Штаммы дикого типа (wt) и ssp1Δ последовательно подвергали воздействию флеомицина и кофеина (или торина-1), после чего анализировали методом проточной цитометрии FACS (от fluorescence-activated cell sorting). Чтобы выяснить, вызывает ли кофеин разобщение репликации ДНК и митоза, клетки окрашивали красителем FxCycle Violet для мониторинга изменений содержания ДНК. При воздействии одного лишь флеомицина у клеток дикого типа не наблюдалось изменений интенсивности окрашивания FxCycle Violet (доля клеток с интенсивностью сигнала выше условного порога 40000 составила 1.03% в момент времени 0 минут и 0.83% через 120 минут; средние геометрические значения интенсивности флуоресценции — 22755 и 23329 соответственно). В случае штамма ssp1Δ при воздействии флеомицина наблюдалось увеличение этого показателя (доля клеток с интенсивностью выше порога 40000 составила 1.09% в момент времени 0 минут и 6.34% через 120 минут; средние геометрические значения — 24581 и 28986 соответственно). Воздействие кофеина на клетки дикого типа в присутствии флеомицина приводило к явному увеличению интенсивности окрашивания FxCycle Violet выше порога 40 000 (доля клеток выше порога — 0.69% против 21.4%; средние геометрические значения — 22611 против 31766). Этот эффект был менее выражен у мутантов ssp1Δ: доля клеток с интенсивностью выше 40000 возросла с 0.69% до 9.49% (средние геометрические значения изменились с 22897 до 30212). С учетом того, что флеомицин сам по себе вызывает увеличение интенсивности окрашивания FxCycle Violet у клеток ssp1Δ, изменение, обусловленное действием кофеина, оказывается даже меньшим по сравнению с клетками дикого типа. При обработке клеток дикого типа или ssp1Δ флеомицином и торином-1 значимых изменений не наблюдалось. В совокупности эти результаты могут указывать на то, что после обработки флеомицином кофеин способен стимулировать репликацию ДНК и митоз механизмом, зависящим от Ssp1. Примечательно, что с помощью метода точечных посевов ученым не удалось выявить различий в чувствительности к повреждению ДНК у штаммов дикого типа и мутантов ssp1Δ, ssp2Δ, cek1Δ, ppk18Δ или igo1Δ при совместном воздействии флеомицина и кофеина либо торина-1.

Изображение №2

Как сообщалось ранее, и кофеин, и торин-1 повышают чувствительность к флеомицину при культивировании в жидкой среде. В этих экспериментах клетки останавливали в развитии с помощью флеомицина, а затем подвергали воздействию кофеина или торина-1 (2A). Наблюдения показали, что торин-1 более эффективно усиливает чувствительность к повреждению ДНК. Комплекс TORC2 необходим для обеспечения устойчивости к повреждению ДНК, поэтому его ингибирование торином-1 может оказывать специфическое влияние на жизнеспособность клеток. Хотя делеция генов ssp1, ssp2 и igo1 устраняла влияние кофеина на митоз, в данных условиях не было обнаружено снижения чувствительности к повреждению ДНК по сравнению с клетками дикого типа. Оба препарата отчетливо повышали чувствительность мутантов ssp2Δ, cek1Δ ppk18Δ и igo1Δ к флеомицину, несмотря на отсутствие прогрессии митоза. Аналогичным образом, и кофеин, и торин-1 повышали чувствительность мутантов igo1Δ к флеомицину так же, как и клеток дикого типа, несмотря на существенные различия в протекании митоза (1F). Кофеин также незначительно повышал чувствительность клеток дикого типа к повреждению ДНК, вызванному флеомицином, в культурах, обработанных в стационарной фазе роста (2B).

Таким образом, кофеин и торин-1 оказывают различное влияние на чувствительность к повреждению ДНК в зависимости от контекста. Кофеин снимает остановку клеточного цикла, вызванную гидроксимочевиной (HU от hydroxyurea), подобно тому, как это наблюдается в случае с флеомицином. В связи с этим ученые решили проверить, может ли кофеин повышать чувствительность к HU (эффект, зависящий от фазы клеточного цикла и белка Cdc25). Далее ученые исследовали влияние кофеина на клетки дикого типа и мутантные клетки в условиях хронического генотоксического воздействия. В этих условиях мутанты по генам ssp2 и amk2 демонстрировали повышенную чувствительность к совместному действию HU и кофеина. Кроме того, мутанты ssp2 и amk2 демонстрировали повышенную чувствительность к одному лишь блеомицину, тогда как совместное воздействие с кофеином оказывалось летальным для всех штаммов (2C и 2D).

Кофеин индуцирует Ssp1-зависимое фосфорилирование Ssp2 по остатку Thr189

Изображение №3

Для дальнейшего изучения влияния кофеина на передачу сигналов с участием Ssp2 ученые использовали описанные ранее фосфоспецифичные антитела. Специфичность этих антител была дополнительно подтверждена с использованием штамма ssp2-T189A. Фосфорилирование Ssp2 по остатку T189 наблюдалось только в штаммах, экспрессирующих белок Ssp2 дикого типа, при воздействии кофеина или среды с содержанием глюкозы 0.03% (3A). Фосфорилирование Ssp2 отчетливо индуцировалось в клетках wt, экспрессирующих Ssp2 с Myc-меткой, при воздействии 10 мМ кофеина в течение 2 часов, хотя и в меньшей степени, чем при дефиците глюкозы. В клетках, подвергнутых воздействию 5 мкМ торина-1 в аналогичных условиях, фосфорилирование Ssp2 подавлялось (3A−3C). Этот процесс фосфорилирования был зависимым от Ssp1. Стрессовые воздействия окружающей среды индуцируют опосредованное Ssp1 фосфорилирование Ssp2. В отличие от описанного ранее кратковременного эффекта 1 М KCl на фосфорилирование Ssp2, при воздействии кофеина этот эффект сохранялся на протяжении 2 часов (3C). Кофеин также усиливал фосфорилирование Ssp2 в клетках, предварительно подвергнутых воздействию флеомицина, тогда как совместное воздействие торина-1 приводило к противоположному результату (3D). Хотя активация Ssp2 происходит при изменении соотношения AMP/ATP, этот белок также может активироваться в ответ на клеточный стресс.

Ранее было показано, что воздействие 1 М KCl приводит к снижению уровня внутриклеточного ATP. Влияние кофеина на фосфорилирование Ssp2 в клетках, предварительно обработанных флеомицином, практически не зависело от уровня ATP, в то время как торин-1 снижал уровень фосфорилированного Ssp2. ATP незначительно подавлял индуцированное кофеином фосфорилирование Ssp2. Кроме того, ATP повышал уровень фосфорилированного Ssp2 в клетках, подвергнутых воздействию флеомицина и торина-1 (3E). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что кофеин активирует Ssp2 независимо от ATP, хотя и может подавлять активность торина-1. ATP не влиял на способность кофеина или торина-1 инициировать переход в митоз клеток, остановленных действием флеомицина (3F). Однако ученые отметили, что клетки с сформированной перегородкой (септой), подвергавшиеся воздействию ATP в присутствии флеомицина и кофеина, были длиннее, чем клетки, обработанные только последними (3G). Кроме того, ATP подавлял влияние кофеина и торина-1 на чувствительность к флеомицину независимо от своего воздействия на ход клеточного цикла (3H). Механизм реализации этих эффектов ATP еще предстоит выяснить.

Таким образом, в отличие от 1 М KCl, кофеин, по-видимому, индуцирует фосфорилирование Ssp2 и прогрессию клеточного цикла независимо от ATP. Фосфорилированный белок Ssp2 перемещается в ядро, где фосфорилирует транскрипционный регулятор Scr1, вызывая его транслокацию в цитоплазму. Следовательно, индуцированное кофеином фосфорилирование Ssp2 должно приводить к выходу Scr1 из ядра. Кофеин вызывал выраженное фосфорилирование Scr1-GFP в течение 1 часа после начала воздействия. В этих условиях также наблюдалась стабилизация Scr1-GFP (3I). В данных исследованиях кофеин (в отличие от торина-1) индуцировал выход Scr1-GFP из ядра, причем этот процесс зависел от белка Ssp1. Интересно, что воздействие кофеина приводило к ранее не описанной пятнистой цитоплазматической локализации Scr1-GFP (3J).

Кофеин модулирует митотическую передачу сигналов, регулируемую комплексом TORC1

Изображение №4

Опосредованное белком Ssp2 ингибирование комплекса TORC1 приводит к подавлению активности Sck2, активации Ppk18, Cek1 и Igo1, а также к последующему ингибированию активности PP2A, что инициирует вход в митоз. В связи с этим ученые исследовали влияние кофеина на регуляцию клеточных сигнальных путей, контролируемых TORC1. Было установлено, что кофеин вызывает зависящее от времени подавление экспрессии Sck2, но не Sck1 (гомолога Sck2, играющего второстепенную роль в регуляции сроков митоза) (4A и 4B). Аналогичный эффект наблюдался в клетках, предварительно обработанных флеомицином: в этих условиях кофеин может индуцировать накопление Sck1 (4C), но при этом подавляет экспрессию Sck2 (4D). Таким образом, кофеин может опосредованно стимулировать активацию Cdc25, ингибировать Wee1 и, как следствие, инициировать митоз за счет подавления экспрессии Sck2 и снижения соответствующей ферментативной активности (4B). Не было обнаружено заметного снижения уровня фосфорилирования Maf1 в клетках, подвергшихся воздействию только кофеина (4E). Ранее сообщалось, что кофеин стабилизирует белок Cdc25 у S. pombe. Следует отметить, что гидроксимочевина (HU), в отличие от флеомицина, индуцирует деградацию Cdc25(12A)-GFPint (4F и 4G).

Ssp2 опосредует влияние кофеина на развитие клеточного цикла при отсутствии передачи сигналов контрольных точек

Изображение №5

Затем ученые исследовали роль Ssp2 в опосредовании эффектов кофеина на клеточный цикл в нормальных условиях роста. Воздействие 10 мМ кофеина или 5 мкМ торина-1 привело к митозу клеток дикого типа в течение 2 часов (5A). Удаление ssp2 частично подавляло влияние кофеина и торина-1 на развитие клеточного цикла (5B, для кофеина, очевидного на 120-минутном этапе). Ранее сообщалось, что мутанты ssp2 проявляют повышенную устойчивость к торину-1 из-за повышенной активности TORC1. Поскольку gsk3 генетически взаимодействует с ssp2, ученые исследовали его роль в опосредовании активности кофеина и торина-1 в отношении AMPK-связанных генов ssp1, ssp2 и amk2. Удивительно, но удаление gsk3 частично подавляло эффекты торина-1 на клеточном цикле, но не кофеина (5C). Удаление gsk3 и ssp2 сильно подавляло влияние кофеина и торина-1 на развитие клеточного цикла (5D). Кроме того, кофеин не смог ускорить прогрессирование клеточного цикла у двойных мутантов gsk3Δ ssp1Δ и gsk3Δ amk2Δ (5E).

Ученые пришли к выводу, что передача сигналов Ssp2 опосредует влияние кофеина на развитие клеточного цикла. Напротив, и Gsk3, и Ssp2 необходимы для опосредования эффектов торина-1 на развитие клеточного цикла. Предполагается, что внутренние уровни активности TORC1 в мутантных клетках gsk3 и ssp2 выше по сравнению с клетками дикого типа. Следовательно, оба гена участвуют в ускорении митоза у S. pombe, но оказывают различное влияние на динамику клеточного цикла. Сообщается, что мутанты, у которых отсутствует Tor1, чувствительны к кофеину. Ученые также отметили, что мутанты tor1Δ и gad8Δ были чувствительны к кофеину, что позволяет предположить, что этот путь обеспечивает устойчивость к препарату (5F).

Ученые сравнили влияние кофеина и торина-1 на развитие клеточного цикла у wt и мутантов gsk3Δ, подвергшихся воздействию флеомицина. Влияние кофеина и торина-1 на чувствительность к повреждению ДНК было частично подавлено у мутантов gsk3Δ (5G и 5H, более очевидно в случае торина-1 в показанных условиях). Неясно, почему Gsk3 опосредует эффекты кофеина в клетках, ранее арестованных флеомицином, но не в нормальных условиях. Эти наблюдения также показывают, что дифференциальные механизмы контролируют соответствующие эффекты кофеина и торина-1 на развитие клеточного цикла посредством прямой и непрямой активации/ингибирования TORC1 и TORC2.

Кофеин усиливает фенотип ssp1Δ в условиях стресса окружающей среды

Изображение №6

Мутанты с делецией гена ssp1 слабо реагируют на влияние кофеина на митоз (1B). Ранее сообщалось, что белок Ssp1 регулирует возобновление клеточного цикла после ингибирования Cdc25, опосредованного киназой Sty1, путем подавления экспрессии Srk1. Поскольку Srk1 ослабляет действие кофеина на ход клеточного цикла механизмом, зависящим от Sty1, ученые исследовали влияние этого белка на мутантный штамм ssp1Δ в условиях теплового и осмотического стресса. При воздействии 1 М KCl в течение 4 и 46 часов клетки мутанта ssp1Δ удлинялись (увеличивался размер клетки в момент деления): с 14.3 мкм и 13.4 мкм до 16 мкм и 25 мкм соответственно. Воздействие одного лишь кофеина в концентрации 10 мМ в течение 4 и 46 часов также приводило к увеличению средней длины клеток с 14.3 мкм и 13.4 мкм до 18.1 мкм и 27.2 мкм соответственно (6A). Микроскопический анализ показал, что после воздействия флеомицина клетки мутантов ssp1Δ были длиннее клеток дикого типа (29.2 мкм против 35.4 мкм). Мутанты ssp1Δ проявляли умеренную чувствительность при высеве клеток, находящихся в стационарной фазе роста, на среду YES с добавлением 10 мМ кофеина. Напротив, мутанты amk2Δ не смогли возобновить рост, что свидетельствует о том, что кофеин усиливает фенотип мутантов ssp1Δ в условиях стресса (6B). При температуре 35°C у мутантов ssp1Δ наблюдается задержка прохождения митоза. Этот эффект значительно усиливался при одновременном воздействии кофеина в концентрации 10 мМ (19.5 мкм против 37.8 мкм через 24 часа). В то же время, в данных условиях как рапамицин (100 нг/мл), так и торин-1 (5 мкМ) оказались достаточными для преодоления фенотипа ssp1Δ (длина клеток составила 15.4 мкм и 21.8 мкм через 24 часа для рапамицина и торина-1 соответственно) (6C). Было показано, что ингибирование комплекса TORC1 рапамицином или делеция гена sck1 позволяют клеткам расти при ограничивающих температурах. Путь Ssp1-Ssp2-TORC1 необходим для пролиферации в присутствии KCl. Кофеин усиливал чувствительность мутантов ssp1Δ и amk2Δ к KCl (6D). Кофеин (10 мМ) и KCl (0.6 М) вызывали деление митохондрий, что наблюдалось по распределению белка Cox4-GFP (6E). Этот эффект был аналогичен действию KCl в концентрации 1 М. В совокупности эти данные указывают на то, что путь Ssp1-Ssp2-TORC1 играет роль в опосредовании влияния кофеина на протекание клеточного цикла как в нормальных условиях, так и в условиях стресса.

Ранее сообщалось, что Amk2 играет роль в репарации повреждений ДНК и ремоделировании хроматина у S. pombe и в клетках млекопитающих. Поскольку кофеин сам по себе является генотоксичным веществом, ученые дополнительно исследовали роль Amk2 в обеспечении устойчивости к кофеину. Было установлено, что Amk2 специфически обеспечивает устойчивость клеток, находящихся в стационарной фазе роста, к воздействию кофеина при высеве на содержащую его среду (6B). При культивировании клеток стационарной фазы в среде YES с добавлением кофеина у мутантов amk2 в течение первых 24 часов наблюдалась значительно более низкая оптическая плотность (O.D. от optical density) по сравнению с клетками дикого типа (wt). Через 48 часов показатели оптической плотности культур amk2Δ и wt сравнялись, что указывает на регуляцию белком Amk2 процессов возобновления клеточного цикла или скорости пролиферации в присутствии кофеина. Эта функция является специфичной для Amk2, так как замедления пролиферации не наблюдалось у мутантов ssp1Δ, ssp2Δ, cek1Δ, ppk18Δ и igo1Δ. Учитывая специфическую чувствительность мутантов ssp2Δ и amk2Δ к флеомицину, а также их повышенную чувствительность к гидроксимочевине в присутствии кофеина (2J), можно предположить, что Amk2 обеспечивает устойчивость клеток стационарной фазы к повреждающему действию кофеина на ДНК. При культивировании в среде с кофеином оптическая плотность клеток дикого типа через 24 часа была примерно в 3 раза выше, чем у мутантов amk2.

Кофеин повышает чувствительность к повреждениям ДНК независимо от своего влияния на клеточный цикл

Изображение №7

Убиквитин-конъюгирующий фермент E2 Rhp6 (входящий в состав комплекса HULC — убиквитин-лигазы гистона H2B-K119) взаимодействует с Cut8 — фактором, обеспечивающим прикрепление ядерных протеасом, — участвуя в процессах репарации ДНК у S. pombe. Кроме того, было показано, что Rhp6 опосредует эффекты кофеина, связанные с клеточным циклом. Таким образом, кофеин может препятствовать репарации повреждений ДНК, осуществляемой при участии Rhp6 и Cut8. Ученые подтвердили, что кофеин даже в концентрации 10 мМ не индуцирует переход в митоз у мутантов rhp6Δ, предварительно подвергнутых воздействию гидроксимочевины (HU) (7A). Напротив, кофеин снимал вызванную HU остановку клеточного цикла у мутантов cut8Δ (7B). Хотя мутанты rhp6Δ сохраняют функциональность контрольных точек клеточного цикла, кофеин повышал их чувствительность к HU (7C и 7E). Наблюдалось удлинение клеток мутантов rhp6Δ, что свидетельствует об остановке цикла под действием контрольных точек, однако клетки оставались чувствительными к HU. Кофеин аналогичным образом повышал чувствительность мутантов cut8Δ к HU (7B и 7D). Возможно, кофеин вызывает специфический тип повреждения ДНК, репарация которого требует участия Rhp6, и тем самым усиливает чувствительность к HU. Мутанты как rhp6Δ, так и cut8Δ демонстрировали высокую чувствительность к флеомицину, причем последние быстро теряли жизнеспособность (на что указывало отсутствие роста клеток в присутствии флеомицина по сравнению с мутантами rhp6Δ) (7C–7E). Кофеин (как самостоятельно, так и в сочетании с рапамицином или торином-1) подавлял экспрессию Cut8 в клетках, предварительно подвергнутых воздействию флеомицина, но не в условиях нормального роста (7F). Эти данные служат дополнительным подтверждением того, что влияние кофеина на чувствительность к повреждениям ДНК не зависит от клеточного цикла.

Для увеличения продолжительности жизни S. pombe под действием кофеина необходим путь AMPK

Изображение №8

Ранее ученые показали, что кофеин увеличивает хронологическую продолжительность жизни (CLS) у S. pombe. Чтобы выяснить, необходим ли путь Ssp1-Ssp2 для увеличения продолжительности жизни, вызванного кофеином, ученые сравнили влияние кофеина на CLS популяций постмитотических клеток (находящихся в стационарной фазе роста) дикого типа (wt), а также мутантов ssp1Δ, ssp2Δ и amk2Δ. Кофеин отчетливо увеличивал CLS клеток дикого типа (8A). Однако кофеин не увеличивал CLS у мутантов ssp1Δ (8B), amk2Δ (8C) и ssp2Δ (8D). Этот результат может быть связан с более ранними данными о том, что данные гены обеспечивают устойчивость к кофеину (изображение №6). Хотя нельзя исключить токсичность кофеина для исследуемых мутантных клеток, обработка кофеином не оказывает пагубного влияния на их хронологическое старение (хотя у ssp1Δ наблюдается очень слабый эффект, не достигающий статистической значимости).

Полуколичественный анализ продолжительности жизни с использованием растущих клеток подтвердил, что мутанты ssp1Δ, ssp2Δ и amk2Δ характеризуются меньшей продолжительностью жизни по сравнению с клетками дикого типа. Ученые провели эти эксперименты в дополнение к стандартным тестам на CLS. Клетки собирали в указанные моменты времени в течение 4 дней (в соответствии с протоколом тестов на CLS), нормализовали по численности и высевали на среду YES (8E). Кофеин отчетливо увеличивал CLS только у клеток дикого типа, что согласуется с ролью генов ssp1, ssp2 и amk2 в обеспечении устойчивости к кофеину (8A–8E). В совокупности полученные данные свидетельствуют о том, что для увеличения CLS под действием кофеина необходимы все компоненты гетеротримера AMPK у S. Pombe.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые установили, что кофеин может влиять не только на активность мозга, но и на древнюю клеточную систему, связанную с энергетическим обменом, ростом, стрессоустойчивостью и восстановлением ДНК.

Кофеин — самое распространенное в мире нейроактивное вещество. Это означает, что он воздействует на нервную систему и активность мозга. Большинству людей он известен как средство, повышающее бодрость, однако ученых также интересовала его возможная связь со снижением риска некоторых возрастных заболеваний. Менее ясным оставался вопрос о том, каким именно образом кофеин вызывает подобные эффекты внутри клеток.

Ученые из лаборатории клеточного старения изучали действие кофеина на дрожжах Schizosaccharomyces pombe — одноклеточном организме, многие клеточные механизмы которого сходны с человеческими. Ранее исследователи обнаружили, что кофеин может продлевать жизнь клеток, воздействуя на регулятор роста TOR.

Команда ученых обнаружила, что кофеин, по-видимому, влияет на старение, воздействуя на глубоко консервативную систему контроля уровня энергии. В биологии консервативными путями называют механизмы, которые оставались неизменными в ходе эволюции, поскольку выполняют жизненно важные функции. Несколько лет назад та же группа исследователей показала, что кофеин может продлевать жизнь клеток, воздействуя на регулятор роста под названием TOR (мишень рапамицина). TOR действует как переключатель клеточного роста. Он помогает клеткам «решать», когда начинать расти, исходя из количества доступных питательных веществ и энергии. Эта система удивительно древняя. Ее разновидности регулируют рост, энергопотребление и реакцию на стресс у живых организмов уже более 500 миллионов лет.

В данном же исследовании было установлено, что вместо прямого воздействия на TOR кофеин, по всей видимости, работает через другую важную клеточную систему — AMPK. AMPK (АМФ-активируемая протеинкиназа) — это клеточный датчик уровня энергии, играющий ключевую роль в поддержании метаболического баланса. Проще говоря, он работает как индикатор уровня энергии, помогая клеткам определять, когда запасы энергии истощаются, и соответствующим образом корректировать свою активность.

Это открытие имеет большое значение, поскольку AMPK присутствует как у дрожжей, так и у людей, что делает этот белок важной мишенью для исследователей, изучающих метаболизм, старение и различные заболевания.

AMPK также связана с метформином — широко применяемым препаратом от диабета, который привлек внимание ученых, занимающихся проблемами долголетия. Метформин известен прежде всего своей способностью контролировать уровень сахара в крови, однако ученые также изучают его влияние на биологические процессы, связанные со старением. Исследуется и потенциальное влияние на продолжительность жизни другого соединения — рапамицина, который воздействует на сигнальные пути, регулирующие рост. В этом контексте связь кофеина с AMPK представляет особый интерес. Исследователи обнаружили, что воздействие кофеина на этот сигнальный путь может влиять на ряд клеточных процессов, связанных со старением и болезнями, включая рост клеток, реакцию на стресс и восстановление ДНК. Восстановление ДНК играет ключевую роль, так как со временем в клетках могут накапливаться генетические повреждения. Если клеткам не удается эффективно устранять эти повреждения, их нормальное функционирование может нарушиться, а риск развития заболеваний — возрасти.\

Как отмечают ученые, эти результаты помогают объяснить, почему кофеин может быть полезен для здоровья и долголетия. Они также открывают интересные перспективы для будущих исследований того, как можно более целенаправленно запускать эти процессы — с помощью питания, образа жизни или новых лекарственных препаратов.

Данное исследование не доказывает, что употребление кофе продлевает жизнь. Эксперименты проводились на делящихся дрожжах, а результаты, полученные на простых организмах, не всегда можно напрямую экстраполировать на человека. Тем не менее тот факт, что AMPK присутствует и у дрожжей, и у людей, дает исследователям важную биологическую подсказку. Кофеин, по-видимому, не просто стимулирует работу мозга. Он также способен активировать древнюю клеточную систему, регулирующую энергетический обмен, реакцию на стресс, рост и процессы восстановления — все то, что играет важную роль в старении клеток.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?