С голубого ручейка начинается река, ну а дружба начинается с взаимовыгодных симбиотических отношений между двумя биологическими субъектами. В суровых условиях дикой природы, когда половина ее жителей хотят тебя съесть, улыбки редко помогают. Но вот что помогает точно, так это вышеупомянутый симбиоз — взаимовыгодная кооперация между особями разных видов. Каждый из участников таких отношений получает что-то свое: защиту, пищу, дом, средство передвижения и т.д. Но вот древесным лягушкам вида Boana prasina симбиоз с определенными бактериями нужен для дел любовных. Сегодня мы познакомимся с удивительными наблюдениями ученых, которые выяснили, что бактерии, обитающие на коже лягушек, способствуют выделению уникального для отдельных полов аромата, играющего важную роль в поиске партнера и, соответственно, в размножении. Зачем ученые нюхали лягушек, чем они пахнут (лягушки, не ученые) и как возник такой необычный симбиоз между амфибией и бактерией? Ответы ждут нас в докладе исследовательской группы. Поехали.

О дружбе в природе

Для человека выгода от дружбы, как правило, носит психологический (эмоциональный) характер. Мы знакомимся с новыми людьми, начинаем дружить и общаться потому, что нам это попросту приятно. То же самое можно сказать и про наших домашних питомцев. Коты, собаки, хомячки, рыбки и т.д. это друзья для человека и скорее моральная, нежели физическая, поддержка. Хотя есть люди, живущие по принципу мамы из мультика «Простоквашино»:

— Ну ты сам подумай, какая от этого кота польза?
— Ну, почему обязательно польза? Какая, например, польза от этой картины на стене?
— От этой картины на стене очень большая польза — она дырку на обоях загораживает!

Но вернемся к флоре и фауне. В дикой природе (симбиоз в контролируемых условия не будем рассматривать) отношения между представителями разных видов нужны для выживания или для более комфортной жизни.


Рыба-клоун в анемоне.

Ярким и одним из самых известных примером являются рыбы-клоуны и морские анемоны (актинии). Рыбки, при виде которых многие восклицают что-то наподобие «о, Немо!», живущие внутри анемон, невосприимчивы к их книдоцитам (стрекательным/жалящим клеткам), а вот хищники очень даже восприимчивы. Другими словами, рыбы-клоуны живут в доме с электрической оградой. Актинии же получают пользу от такого соседства в виде питательных веществ из продуктов жизнедеятельности рыб (да, фраза «де***овые отношения» для актиний звучит достаточно буквально).


Еще один необычный симбиоз некоторые виды анемон формируют с раками-отшельниками.

Из глубин морских переместимся на цветущую поляну. Кого мы всегда представляем рядом с цветком? Конечно же, пчел. Эти трудоголики собирают нектар с цветков, то есть получают пищу. При этом, перелетая с цветка на цветок, они осуществляют так сказать опосредованное опыление, чем помогают растениям в размножении. Другими словами, на вопрос «ты что, свечку держала?» пчела ответила бы утвердительно, после чего ужалила бы вас за такие неподобающие вопросы.


Пчелы на подсолнухе.

Кроме пчел в процессе опыления растениям помогают и другие виды насекомых (муравьи, шмели, бабочки и т.д.), а также и позвоночные животные (птицы, летучие мыши, грызуны и т.д.).

Как мы с вами уже поняли, симбиотические отношения не являются редкостью. Нас скорее удивляют участники этих отношений, нежели сам факт их существования.

Стоит отметить, что запах это химический сигнал, который позволяет получить определенную информацию о его источнике. Запахами, как способом обмена информацией, пользуются далеко не только лягушки, но и многие виды позвоночных. Вспомните, что делают коты (особенно часто весной) — таким образом они оповещают других представителей своего вида о своем присутствии, праве на территорию и т.д. Если рассматривать источники запахов в целом, то выделяют несколько основных источников:

• первичный (de novo) секреторный синтез в определенных железах;
• побочные продукты экскреции, то есть выделений жизнедеятельности организма;
• использование окружающей среды;
• продукты жизнедеятельности симбиотических бактерий.

Еще в 70-ых годах прошлого века была высказана «теория ферментации», в которой утверждалось, что симбиотические бактерии у млекопитающих метаболизируют белки и липиды, встречающиеся в ароматических железах. Следовательно, производятся летучие соединения, которые носитель использует для связи.


Квакающая тигровая лягушка.

Если же говорить о лягушках и жабах, то тут основным методом передачи информации (т.е. коммуникации) всегда считались звуки (акустические сигналы). А вот запахам не приделали особого внимания, считая их не столь важными в данном процессе. Оказалось, что это все иначе. Мало того, что запах очень важен в передаче информации (определение пола, привлечение партнера, защита от хищников и т.д.), так он еще и возникает при помощи симбиотических организмов, а именно бактерий.

Ученым удалось выяснить, что секрет, выделяемый кожей лягушек, содержит в себе органические сульфиды*, сесквитерпены* и метоксипиразины*. Источником этих химических соединений оказались бактерии из группы Pseudomonas, обитающие на коже исследуемых особей.

Органические сульфиды* — серосодержащие аналоги простых эфиров.

Сесквитерпены* — группа органических соединений из класса терпенов, в состав которой входят углеводороды от С₁₅Н₂₄ до С₁₅Н₃₂.

Метоксипиразины* — химические соединения, производящие запахи.

Как я уже упоминал ранее, в качестве испытуемых ученые выбрали древесных лягушек вида Boana prasina, обитающих в южноамериканском регионе. У данного вида довольно длительный репродуктивный период, во время которого самцы используют акустические сигналы и выделяют очень сильный и характерный запах. Ученые подчеркивают, что исследования роли запахов в социальной активности древесных лягушек уже проводились, однако источник этих запахов еще не был исследован.

А теперь, познакомившись с понятием симбиоз, участниками исследования и целями ученых, приступим к ознакомлению с результатами наблюдений.

Результаты исследования

Посредством ТФМЭ (твердофазной микроэкстракции) и ГХ/МС (газовой хроматографии/масс-спектрометрии) ученым удалось установить, что в состав летучей секреции кожи самцов и самок вида B. prasina входит порядка 60-80 различных химических соединений, среди которых: спирты, альдегиды, алкены, эфиры, кетоны, метоксипиразины, терпены (гемитерпены, монотерпены и сесквитерпены) и тиоэфиры.


Изображение №1: сравнение химического состава летучей секреции кожи самцов и самок вида B. prasina.

Обозначения к графику выше: Mop — метоксипиразины; Het — гемитерпены; Mnt — монотерпены; Sqt — сесквитерпены; Hyc — углеводороды; Toe — тиоэфиры; Eth — эфиры; Ket — кетоны; с* — ароматические соединения, также встречающиеся в террариумах.


Таблица №1: данные химического анализа летучей секреции кожи самцов и самок вида B. prasina.

При этом оказалось, что большую часть всего этого «ароматного супа» у обоих полов составляют гемитерпены, кетоны и спирты (49,9–78,3%).

Если же сравнивать химический состав для определения его отличий у самцов и самок, то тут выделяются SQT (сесквитерпены), TOE (тиоэфиры) и MOP (метоксипиразины), что видно по 2А и 2В.


Изображение №2: сравнительный анализ химического состава секреции самцов и самок.

Двойной график 2А построен по относительному содержанию летучих соединений. Центроиды дисперсии образцов изображены в виде круга для самок и треугольника для самцов. Изображение 2В показывает относительный вклад каждого класса химических соединений в первые четыре основных компонента, полученных в анализе PCA (метод главных компонентов). Размер круга указывает на абсолютное значение вклада, а цвет (от красного к синему) — отрицательный или положительный этот вклад.

Благодаря созданию функции ЛДА (линейного дискриминантного анализа) ученым стало очевидно, что отличить пол особи можно посредством химического профиля (2С): критерий Крускала-Уоллиса: DF = 1, P = 0.001.

Небольшое пояснение терминологии в данных:

• под словом «взаимодействие» подразумевается то, что в анализе данных учитывались оба фактора — пол особи и метод взятия проб;
• под словом «пол» подразумевается анализ данных исключительно для определения пола при определенных условиях взятия образца;
• in vivo — анализ на живом организме (не на образце, взятом из него);
• образец — анализ проб кожи, взятых у живой особи (анализировался отдельно от самой особи).

Из трех самых отличительных классов (TOE, SQT и MOP) именно MOP (метоксипиразины) были более выражены у самок, чем у самцов. Это видно по результатам теста отношения правдоподобия. Взаимодействие: ?²₁ = 1,20; P = 0,2729; пол: ?²₁ = 12,778; P = 0,0004.

При этом у самцов показатели SQT (сесквитерпены) были выше, чем у самок. Взаимодействие: ?²₁ = 23,817; Р < 0,0001; пол (in vivo): ?²₁ = 22.933; P < 0.0001; пол (образец): ?²₁ = 1.317; P = 0.2511.

И наконец, анализ данных TOE (тиоэфиры) показал, что у самцов данного химического соединения больше, но только при анализе на живой особи (in vivo). Взаимодействие: ?²₁ = 10,618; P = 0,0011; пол (in vivo): ?²₁ = 10,9505; P = 0,0009; пол (образец): ?²₁ = 2,0051; P = 0,1568.

При более детальном рассмотрении состава SQT и TOE ученые выделили два основных вещества, которые были выражены наибольшим образом, а именно дигидроэдулан II в SQT и C₆Н₁₂S в TOE.

Далее исследователи решили более детально разобраться с метоксипиразинами (MOP), коих было выделено аж 4 штуки:

• MOP1 — 2-изопропил-3-метоксипиразин (C₈H₁₂N₂O)
• MOP2 — 3-изопропил-2-метокси-5-метилпиразин (C₉H₁₄N₂O)
• MOP3 — 2-втор-бутил-3-метоксипиразин (C₉H₁₄N₂O)
• MOP4 — 3-втор-бутил-2-метокси-5-метилпиразин (C₁₀H₁₆N₂O)

Изображение №3: данные по всем четырем типам МОР у самцов и самок.

Как видно из данных анализа, МОР3 очень сильно выражен у самцов, но не у самок в независимости от метода анализа (взаимодействие: ?²₁ = 0,1219; P = 0,727; пол: ?²₁ = 49,4548; P <0,0001).

А вот МОР4 наоборот сильно выражен у самок, а не у самцов (взаимодействие ?²₁ = 5,3977; P = 0,0202; пол (in vivo): ?²₁ = 25,5523; Р <0,0001; пол (образец): ?²₁ = 33.1275; Р <0,0001).

МОР1 и МОР2 были довольно слабо представлены у обоих полов и в совокупности составляли примерно 0-12.8% от общего числа метоксипиразинов.

С данными, цифрами, сравнениями «у кого больше» мы разобрались, а теперь к самому интересному.

Дело в том, что TOE и MOP это химические соединения, которые вырабатываются (как правило) микроорганизмами. Посему ученым необходимо было проверить так ли это в случае древесных лягушек. Были взяты образцы из которых были выделены, культивированы и идентифицированы бактерии, связанные с кожей.

Из, внимание, 128 летучих метаболитов у бактерий ученые определили 16, которые были также и у лягушек. А также было выявлено 5 соединений, которые имелись только у бактерий.


Изображение №4: 4А — МОР, найденные в коже лягушек (1-4) и в бактерии Pseudomonas (5-8), 4В — ГХ/МС хроматограмма полного ионного тока, показывающая выработку МОР 1-8 (слева) бактерией Pseudomonas, культивированной в агаре Мюллера–Хинтона (справа).

И вот еще очень интересный факт — все 4 типа МОР (мы рассматривали их ранее) продуцировались одним единственным бактериальным изолятом. Помимо присутствующих у лягущен МОР 1-4, бактерия производила еще несколько дополнительных (5-8 на изображении 4А), которых у лягушек выявлено не было. Также стоит отметить, что у бактерий самым «массовым» МОР был номер 5 (C₇H₁₀N₂O или 2-метокси-3,5-диметилпиразин), составляющий примерно 82,4 ± 16,7% от общего числа метоксипиразинов.

Сравнение показателей МОР1-4 у бактерии и у лягушек показал, что МОР2 в бактерии выражен лучше (5,9 ± 6,9%), а вот MOP3 и MOP4 хуже, чем у лягушек (2,6 ± 5,0% и 2,7 ± 2,1%, соответственно).


Изображение №5: популяция бактерий на коже испытуемых, взятых из разных регионов, и в разный период времени.

Особи для исследования были взяты из дикой природы, точнее из 4 разных регионов (5А). Численность бактерий отличалась у особей из разных регионов и зависела от времени, проведенного в неволе (5В).

Несмотря на вариации более половины численности действующих таксономических единиц (OTU), наблюдаемых в колониях бактерий кожи на четырех участках (60–63%) и в пяти разных периодах взятия проб (56–66%), могут быть идентифицированы как представители следующих семейств бактерий: Enterobacteriales, Pseudomonadales, Methylophilales, Oceanospirillales, Actinomycetales, Bacillales, Alteromonadales и Burkholderiales. Самыми выраженными среди этого многообразия были Klebsiella (Enterobacteriales) и Pseudomonas (Pseudomonadales). Это отображено на графиках 5А и 5В.

Особых отличий между испытуемыми особями с разных регионов не было обнаружено. Но вот влияния времени в неволе было ощутимым. Так, многообразие бактерий и их численность снижалась с течением времени (в неволе): 1-й день — 163 ± 26, 3-й: 145 ± 35, 10-й: 100 ± 9, 2 недели: 104 ± 41 и 8 месяцев: 155 ± 34.

Разница, зависящая от региона обитания и времени в неволе, была видна и среди бактерий Pseudomonas. Некоторые OTU были обнаружены только у лягушек из определенного региона (5С) или проявлялись уже в неволе (5D). Но 4 вида бактерий из этого рода все же встречались у большинства образцов, то есть не зависели от географических факторов и времени в контролируемой лабораторной среде. При этом присутствовала разница численности бактерий Pseudomonas у самцов (в среднем 1.7%) и самок (в среднем 2.4%). Эти показатели снизились за время пребывания в неволе у обоих полов, особенно за первые 3 дня: с максимального в первый день 8.8 ± 4.3% до максимума на 3-й — 0.4 ± 0.2%.

Учитывая проанализированные данные можно прийти к выводу, что именно бактерии Pseudomonas принимают активное участие в секреции летучих соединений, которые применяются носителем, т.е. лягушками, для определения пола, привлечения партнера во время периода размножения и в качестве защиты от хищников.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад исследовательской группы и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Факт того, что запахи играют крайне важную роль в жизни многих живых организмов, в том числе и амфибий, был известен уже довольно давно. Однако подобных исследований, целью которых является выявление первоисточника этих запахов и механизмов выработки летучих химических соединений, еще не проводилось.

Ученым удалось выяснить какие именно химические соединения важны для формирования запаха и что их вырабатывает. Кожа древесных лягушек является домом для целого ряда бактерий из разных семейств. Ученые предполагают, что синтезируемые кожей амфибий биомолекулы служат фильтром, посредством которого на коже могут обитать уникальные комбинации разных видов бактерий. А летучие соединения, выделяемые MOP-продуцируемыми бактериями Pseudomonas в коже лягушки могут выступать в качестве инфохимических веществ, то есть способом коммуникации между самими бактериями.

В свою очередь древесные лягушки пользуются этим как одним из видов сигналов, подаваемым другим особям во время брачного периода наряду с акустическими сигналами, что подтверждено поведенческими тестами в дикой природе и в лабораторных условиях.

В дальнейшем исследователи собираются продолжить свою работу, дабы более детально изучить взаимодействие бактерий и древесных лягушек. Данный же труд ученые называют первыми шагами в понимании симбиотических взаимоотношений между амфибиями (и не только) и различными микроорганизмами.

Да, подобные исследования может и не несут никакой практической пользы для человечества, хотя рано пока говорить об этом, ибо одно открытие может повести за собой череду новых, которые как-то может и повлияют на нашу жизнь. Но что точно дают эти исследования, так это знания и понимание аспектов окружающего нас мира, о котором мы пока что знаем далеко не все.



Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5-2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до лета бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.

Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel Dodeca-Core Xeon E5-2650v4 128GB DDR4 6x480GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $249 в Нидерландах и США! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?