У современного мира много современных проблем, которых не существовало триста и даже сто лет назад из-за отсутствия нынешнего уровня технологического прогресса. Как правило, большая часть проблем уходит в сторону экологии. А когда разговоры заходят о загрязнении окружающей среды, то одним из лидеров в этом аспекте является вездесущий пластик. Этот универсальный материал можно найти и в производстве сложнейших аппаратов, и на кухне. Полезность пластмассы никто не может оспорить, а поиски замены пока не увенчались успехом, ибо пластик легок в производстве и стоит дешево, в отличие от предлагаемых более экологичных вариантов. Поcему исследований, нацеленных на решение проблемы пластиковых отходов, достаточно много, и каждое из них предлагает свой уникальный подход. На Хабре уже была новость об этом исследовании, но мы, как обычно, рассмотрим его подробнее. Ученые из Эдинбургского университета (Великобритания) предложили использовать бактерию E. coli (кишечная палочка) для преобразования пластиковых отходов в ванилин. Какую роль исполняет бактерия, какие процессы лежат в основе столь необычного преобразования, и можно ли употреблять в пищу полученный таким путем ванилин? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Важность и полезность пластика сложно преуменьшить. Он используется во многих отраслях производства, не говоря уже о его распространенности в быту. Попросите кого-то показать три предмета из пластика, лежащие в квартире, и эта задача будет выполнена моментально. Для примера, я сижу за столом с пластиковыми деталями, на нем стоит лампа с пластиковым корпусом, мышка с пластиковым корпусом, ноутбук с пластиковыми клавишами и т.д. В общем, картина яснее некуда.

Однако проблема пластиковых отходов является на данный момент одной из самых серьезных в аспекте экологии. К тому же существует и экономический подтекст (который куда важнее экологии для многих предпринимателей и производств) — из-за того, что 95% пластиковых изделий теряют свою материальную стоимость уже после первого использования, мировая экономика теряет примерно 110 миллиардов долларов в год.

Неудивительно, что исследования, нацеленные на решение проблемы с пластиковыми отходами, столь многочисленны. Среди них в последнее время все чаще встречаются труды, основанные на микробиологии, биокатализе, направленной эволюции, синтетической биологии и неферментативном катализе. В частности, ученые достигли хороших результатов в области ферментативному разложению ПЭТ (полиэтилентерефталат, (C₁₀H₈O₄)_n). Одними из самых многообещающих ферментов стали варианты ПЭТазы из бактерии Ideonella sakaiensis и кутиназы (фермент, катализирующий гидролиз кутина) из компоста ветвей и листьев (LCC от leaf and branch compost cutinase). Отличие в том, что ПЭТаза и ее модифицированные варианты работают при температуре окружающей среды (30–37 °C), высвобождая бис- и моно-(2-гидроксиэтил) терефталат. Фермент из LCC является термостабильным (72 °C).

Помимо очевидного плюса в виде ускоренного разложения пластикового мусора, вышеописанные методы также имеют свое применение и в повторном производстве. К примеру, в ходе разложения ПЭТ методом LCC образуется ТА (thioacrylate, т.е. тиоакрилат), который можно использовать в качестве сырья для производства ПЭТ второго поколения и в качестве строительного блока для синтеза металлоорганических каркасов.

Учитывая эти изыскания, ученые предложили свой метод, результатом которого должно стать преобразование полученного в ходе LCC разложения ТА в ванилин посредством ферментации (1b). Ванилин (в обычных условиях) получают из экстракта стручков ванили. Это широко используют в пищевой промышленности, в косметике, и даже в фармакологии. По данным на 2018 год глобальное потребление ванилина составляет порядка 37000 тонн в год. По прогнозам эта цифра возрастет до 59000 тон к 2025 году.

Спрос на ванилин, как мы видим, очень велик, но он не соответствует мощностям его производства естественным путем (из ванили). Посему проводилось немало исследований, нацеленных на создание искусственного (синтетического) ванилина. Самым широко используемым на данный момент считается производство ванилина из биомассы лигнина (вещество, характеризующее одеревеневшие стенки растительных клеток). Также существуют методы ферментации ванилина из феруловой кислоты, глюкозы, глицерина, L-тирозина, ксилозы, куркумина, эвгенола и изоэвгенола, когда используются микробные и грибковые организмы-носители (1c).


Изображение №1

Авторы исследования заявляют, что о преобразовании ТА в ванилиновую кислоту (VA от vanillic acid, C₈H₈O₄) известно, но на практике никто еще не пытался это реализовать. В своем труде они предложили объединить этот метод с LCC разложением ПЭТ для получения ванилина непосредственно из бытовых пластиковых отходов при температуре окружающей среды и в водных условиях.

Результаты исследования

Дабы получить желаемый результат, ученым в первую очередь необходимо было создать новый ферментативный путь для превращения ТА (тиоакрилат) в ванилин. В качестве организма-носителя был выбран штамм E. coli MG1655 RARE, так как данная бактерия способна восстанавливать альдегиды до соответствующего спирта. Ранее этот штамм уже использовался для получения ванилина, но из глюкозы.

Предположительно ТА может превращаться в ванилин с помощью ферментативного пути, включающего (2a):

• терефталат-1,2-диоксигеназа (TPADO);
• дегидрогеназа дигидрокси-3,5-циклогексадиен-1,4-дикарбоновой кислоты (DCDDH);
• редуктаза карбоновой кислоты (CAR);
• катехол-O-метилтрансфераза (COMT).

Изображение №2

Ученые отмечают, что CAR и O-MT принимают PC (протокатеховая кислота, C₇H₆O₄), дигидроксибензальдегид (DHBAl) и ванилиновую кислоту (VA) в качестве субстратов, так что ферментативный путь может протекать через два возможных промежуточных продукта (VA или DHBAl) с образованием ванилина.

Ферменты данного ферментативного пути были собраны в две плазмиды*, названные pVan1 и pVan2.

Плазмиды* — молекулы НДК, отделенные от хромосом и способные к самостоятельной репликации.

pVan1 кодирует TPADO (гетеротример, содержащий субъединицы TphA1, TphA2 и TphB2) и DCDDH от бактерии Comamonas sp., которые вместе катализируют превращение TA в PC с использованием кислорода из воздуха в качестве окислителя. Оба фермента экспрессируются в E. coli.

pVan2 кодирует редуктазу карбоновой кислоты из бактерии Nocardia iowensis (NiCAR) и одноточечный мутант растворимой формы катехол-O-метилтрансферазы (S-COMT Y200L) из бактерии Rattus norvegicus (2b). Этот мутант был выбран из-за его высокой стереоселективности в отношении метилирования в мета-положении PC и DHBAl. NiCAR был выбран для стадии восстановления.

Кроме того, клетки были котрансформированы третьей плазмидой, кодирующей фосфопантетеинилтрансферазу (pSfp) из бактерии Bacillus subtilis, которая необходима для посттрансляционной модификации NiCAR.

В процессе создания работающего пути ферментации были проведены тесты. Так, варианты, в которых экспрессировалась только pVan1 либо отсутствовал ТА-субстрат ванилина в результате не было обнаружено. Зато в опытах, где клетки экспрессировали все три плазмиды с добавленным ТА (5 мМ) было образование ванилина (5 мкМ, конверсия < 1%; 2c). При этом промежуточные соединения PC, DHBA1 и ванилиновая кислота также обнаруживаются при концентрациях 18 мкМ, 10 мкМ и 2 мкМ соответственно.

Однако таких результатов недостаточно, потому процесс обходимо было оптимизировать. Анализ сред для экспрессии белка показал, что лучшим вариантом питательной среды* является М9 с примесью казаминовых кислот (M9-CA).

Питательная среда* — субстрат для культивирования микроорганизмов или культур клеток высших организмов. М9 среда — минимальная (минимально необходимая) питательная среда, используемая для бактериальных культур.

Изображение №3

Ресуспендирование (повторное суспендирование*) целых клеток в среде M9 оказалось более эффективным, чем добавление ТА к экспрессирующим культурам во время фазы экспоненциального роста, что дало 4-кратное увеличение титров ванилина (77 ± 11 мкМ; 3a).

Суспендирование* — образование суспензии, т.е. частиц твердого вещества, распределенных в жидкой среде во взвешенном состоянии.

Добавление в питательную среду микроэлементов привело к увеличению титров PC в 1.5 раза (3c). При этом добавление бензилового спирта (BnOH) без каких-либо микроэлементов повышало уровень титров PC в два раза.

Далее было проведено исследование влияния условий биотрансформации целых клеток на превращение ТА в ванилин и промежуточных продуктов ферментативного пути.

Поскольку TPADO является O₂-зависимым, увеличение свободного пространства реакции должно повысит конверсию TA в PC. Это было подтверждено увеличением титров ванилина (от 5 ± 3 мкМ до 327 ± 15 мкМ), когда отношение свободного пространства к реакционному объему было увеличено с 1:5 до 1:99.

Дополнительное улучшение преобразования TA в ванилин было достигнуто путем увеличения проницаемости клеточных мембран E. coli для ТА. Для этого к буферу биотрансформации было добавлено 1% N-BuOH, что приводило к трехкратному увеличению преобразования TA в ванилин (3b).

Важную роль для этого процесса играл и уровень pH. Если он нейтрален, то диффузия TA через клеточную мембрану не происходит. Анализ показал, что pH 5.5 является идеальным вариантом для достижения баланса максимальной диффузии ТА в клетку и минимального индуцированного кислотой стресса для клетки.

Еще более важным аспектом была температура (3e). Снижение температуры реакции с 30 °C до 22 °C дало 5-кратное увеличение выхода ванилина (577 ± 22 мкМ по сравнению с 117 ± 40 мкМ при 30 °C). Дальнейшее снижение температуры (до 16 °C) более не давало каких-либо положительных эффектов.

Ученые предположили, что применение методики ISPR* может увеличить выход ванилина за счет снижения его токсичности для E. coli и за счет увеличения потока к ванилину — наиболее гидрофобной молекуле в этом пути.

Удаление продукта на месте* (ISPR от in situ product removal) — это быстрое удаление продукта из продуцирующей клетки, предотвращающее его последующее вмешательство в клеточные компоненты или компоненты среды.

Из трех исследованных вариантов реализации ISPR (слои органических растворителей; захват продукта биосовместимыми мицеллами или ?-циклодекстрином; улавливание продукта посредством обратимого нуклеофильного присоединения к альдегидной части DHBAl и ванилина) был выбран второй вариант. Если точнее, то были использованы биосовместимые мицеллы TPGS-750-M, полученные из олеилового спирта (OA) и витамина E. Этот вариант давал максимальный выход ванилина при минимальных уровнях промежуточного DHBAl. При использовании OA из 1 мМ ТА удалось получить 744 мкМ ± 100 мкМ ванилина. Исследование динамики реакции показало, что максимальный результат достигается спустя не менее 16 часов (3f).

Результатом вышеописанных анализов и исследований стала оптимизированная процедура преобразования TA в ванилин. Основные аспекты оптимизации: клетки E. coli штамма RARE_pVanX ресуспендировали в M9-глюкозе с добавлением L-Met и nBuOH; уровень pH был 5.5; инкубация с TA в течение 24 часов при комнатной температуре; применение олеилового спирта.


Изображение №4

Методика была готова, оставалось лишь проверить ее на практике. Для практического опыта был выбран термостабильный фермент LCC WCCG15 (далее LCC) в качестве биокатализатора, чтобы способствовать гидролизу ПЭТ в ТА. В отличие от ПЭТазы из Ideonella sakaiensis, LCC высвобождает ТА напрямую и не требует дополнительного фермента для гидролиза моно-2-гидроксиэтилтерефталата для высвобождения ТА.

ПЭТ (в данном случае использованные пластиковые бутылки) обрабатывали полуочищенным LCC при 72 °C (4а). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и добавляли свежеприготовленную E. coli RARE_pVanX и концентрат буфера для биотрансформации. Спустя 24 часа проводился анализ реакции.

Ванилин был обнаружен еще до оптимизации (68 мкМ; 4b). В контрольных группах, где не было либо ПЭТ, либо клеток, экспрессирующих ферменты, ванилина не было. В случае без LLC ванилин был, но в очень малом количестве, что предположительно связано с фоновым гидролизом ПЭТ в реакционном буфере LCC (pH 10) в отсутствие LCC. Добавление олеилового спирта не привело к значительному увеличению титров ванилина, что предположительно связано с более низкими концентрациями ТА в результате разложения ПЭТ (300–400 мкМ).

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученые решили описать крайне необычный, но весьма эффективный метод борьбы с пластиковыми отходами — преобразование в ванилин. Для реализации этого процесса использовалась бактерия E. coli. Сама же реакция является достаточно простой, так как в ней используется цельноклеточный катализатор, полученный из возобновляемого сырья. Сама же реакция протекает в условиях окружающей среды (комнатная температура и pH 5.5-7), в водной среде и не требует дополнительных реагентов или кофакторов. Кроме того, реакция не производит никаких опасных побочных продуктов.

В ходе практических опытов удалось достичь выхода ванилина в 785 мкМ (119 мг/л), т.е. конверсия составила 79%. Столь впечатляющие результаты были получены не сразу, а спустя множество попыток, нацеленных на оптимизацию процесса.

Полученный ванилин, по словам ученых, вполне безопасен для человека и может использоваться в пищевой промышленности, как и его естественный эквивалент. Однако для пущей уверенности они намерены провести ряд дополнительных тестов, подтверждающих это.

К сожалению, многие предприятия готовы задуматься об экологии только в том случае, если использование экологически небезопасного сырья или технологии грозит им экономическими потерями. Конечно, это цинично и меркантильно с их стороны, но их опасения в случае полного перехода на экологически чистое производство вполне осязаемы. Ведь никто не говорит, что это сделают все одновременно, в том числе и их конкуренты. Тем более подавляющее большинство людей, к сожалению, предпочтут продукт дешевый и неэкологичный, нежели дорогой, но безопасный для окружающей среды. Не все, конечно, но все же большинство.

Посему разработки подобного плана удовлетворяют обе стороны — тех, кто готов отдать все за экологию, и тех, кто в первую очередь думает о прибыли. Пока не придумано идеального универсального метода решения экологической проблемы, который подойдет всем, нам придется использовать такие вот компромиссные варианты. Хорошо это или плохо, сказать пока сложно, однако это лучше, чем ничего.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и хорошей всем рабочей недели, ребята.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?