Одним из двигателей прогресса, помимо лени, стоит по праву называть человеческое любопытство. Задавая массу вопросов, касающихся вещей, процессов и явлений, что нас окружают, мы смогли получить немало ответов. Но, как это часто бывает, ответы порождают новые вопросы и новые задачи, решение которых требует поиска ответов на другие вопросы. Подобная цепочка причинно-следственных связей затронула и тканевую инженерию (TERM от tissue engineering and regenerative medicine). В процессе развития TERM было выделено две основные стратегии создания новых тканей — с каркасами и без них. Однако имеется и третий вариант, который в теории мог бы превзойти предыдущие два вместе взятые. Ученые из Венского технического университета (Австрия) провели первое в мире полноценное исследование данного метода, основой которого являются высокопористые микроскаркасы, позволяющих создавать отдельные сфероиды внутри каждого из них. Какие особенности данных структур, насколько эффективен новый метод, и где он может применяться? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

TERM, т.е. тканевая инженерия и регенеративная медицина, это направление, которое нацелено на восстановление, замену или регенерацию тканей и органов. Такое определение звучит крайне оптимистично и не менее футуристично, однако существует ряд проблем и сложностей, которые предотвращают полноценное изготовление тканей большого размера с высокой клеточностью. Текущие методы TERM можно разделить на два основных типа: каркасные и бескаркасные.

В первом случае было предложено множество каркасов, функции которых в основном заключаются в том, чтобы временно поддерживать клеточную адгезию, пролиферацию и отложение внеклеточного матрикса (ECM от extracellular matrix). Основная идея данного метода заключается в том, что кинетика деградации этого сконструированного шаблона будет соответствовать образованию новой ткани. Одной из основных проблем данного подхода до сих пор остается получение in vitro (в пробирке, т.е. вне живого организма) конструкций с высокой плотностью клеток.

Второй вариант, т.е. бескаркасный, включает сфероиды, а не суспензии отдельных клеток. Ранее проведенные исследования показали, что трехмерные сфероиды действительно лучше имитируют поведение клеток in vivo (внутри клетки или живого организма) и биологическую функциональность по сравнению с двумерными клеточными монослоями. Сфероиды, представляющие собой плотные клеточные агрегаты, преодолевают многие текущие ограничения, существующие при трансплантации отдельных клеток. Например, использование сфероидов, а не суспензии отдельных клеток, показало лучшую выживаемость клеток, повышенное сохранение клеток и улучшенную функциональностью в нескольких доклинических испытаниях.

Еще одной полезной, а потому и интересной для ученых, особенностью сфероидов является возможность их использования в качестве строительных блоков (модульных единиц ткани). При расположении близко друг к другу сфероидные единицы могут сливаться, образуя одно тело (в процессе, называемом слиянием). Такая направленная сборка ткани является недавним и многообещающим подходом, который обеспечивает повышенный уровень контроля для организации строительных блоков в желаемые паттерны, которые затем могут формировать более крупную ткань макроразмера.

Однако и тут есть свои проблемы. В частности, использование только клеточных сфероидов в качестве строительных блоков по сравнению с прочным каркасом накладывает внутренние ограничения, поскольку клетки не защищены от каких-либо механических повреждений, которые могут возникнуть во время обработки или после помещения внутрь организма.

Другими словами, оба метода обладают рядом выдающихся характеристик, но и рядом не менее выдающихся проблем. В попытках решить все эти проблемы всем скопом ученые обратили внимание на сборку небольших и биомиметических повторяющихся единиц, состоящих, например, из клеточных гидрогелей (т.е. микрогелей). Однако, поскольку встраивание клеток в микрогели сильно ограничивает межклеточное взаимодействие, единицы теряют способность к самосборке в более крупную конструкцию. Следовательно, объединение этих строительных блоков в более крупную ткань требует внедрения более сложных процессов, таких как эмульгирование, физическая упаковка или химическое сшивание.

Альтернативой микрогелям могут быть полимеры. Инкубируя эти «микрообъекты» с клеточной суспензией, сборки макротканей могут быть сформированы посредством взаимодействия клетка-клетка или клетка-ECM (extracellular matrix, т.е. внеклеточный матрикс). Тем не менее основное ограничение данного метода в том, что степень клеточности значительно ниже (по сравнению, например, со сфероидами), поскольку эти полимерные блоки не являются пористыми.

Посему ученые пришли к выводу, что создание высокопористых микрокаркасов, способных нести полные сфероиды, устранило бы эту проблему. Ранее уже было показано, что высокопористые подобные клетке микрокаркасы могут не только нести клетки, но также поддерживать формирование сфероидов в их ядре. Этот новый подход, называемый «третьей стратегией для TERM», существенно отличается от традиционных вариантов, т.е. каркасного и бескаркасного методов.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые решили провести систематическое и сравнительное исследование между нормальными сфероидами (SPH) и тканевыми единицами на основе бакибола* (BB), чтобы лучше понять, как ведут себя стволовые клетки в таких гибридных клеточно-полимерных сфероидах с точки зрения пролиферации, жизнеспособность, сохранение формы, слияние и дифференциация.

Бакибол* — альтернативное название бакминстерфуллерена (C₆₀), т.е. фуллерена. Фуллерен — молекулярное соединение, представляющее собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из трёхкоординированных атомов углерода.


В контексте данного исследования бакибол является определением формы микрокаркаса, а не самой молекулы C₆₀.

Используя стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека (hASC), данные опытов in vitro показывают, что при выборе подходящей конструкции и пористости внутри микрокаркасов могут образовываться клеточные сфероиды.

Результаты исследования

Как заявляют ученые, предпосылкой для третьей стратегии TERM является, во-первых, возможность производить микрокаркасы, которые могут содержать в своем ядре одиночные многоклеточные сфероиды.

Чтобы определить оптимальное окно обработки двухфотонной полимеризации (2PP от two-photon polymerization) для материала (т. е. светочувствительной смолы на основе PCL — polycaprolactone или поликапролактона), было проведено первое испытание на пригодность к печати с изменением мощности лазера на кубических структурах (1a). Во всех этих тестах печати скорость лазерной записи поддерживалась постоянной и составляла 10000 мм/с.

Хорошее качество структуры наблюдалось при печати кубов с использованием мощности лазера от 40 до 100 мВт. Ниже и выше этого окна обработки материал либо не полностью полимеризовался, либо сгорал.


Изображение №1

После этого предварительного теста была проведена дополнительная настройка окна пригодности для печати посредством выбора мощность лазера от 35 до 85 мВт. Это испытание проводилось на ВВ конструкциях (1b) с общим диаметром 300 мкм и диаметром распорки 35 мкм. Печать BB с низкой мощностью лазера (т.е. 35 мВт и 45 мВт) приводила к многочисленным разрушенным или деформированным структурам (1c). Качество структурированного BB улучшилось за счет использования более высоких мощностей лазера. Оптимальный результат был получен при мощности лазера в 65 мВт. Аналогичные результаты были получены для структур, напечатанных при мощности 75 мВт и 85 мВт.

Основное отличие заключалось в том, что при мощности лазера 85 мВт окно еще более увеличилось, и BB с соответствующей архитектурой были получены при расстоянии между печатным слоем (dZ) до 4.2 мкм и межстрочном расстоянии (штриховка) до 2.5 мкм. Снимки SEM подтвердили это наблюдение, поскольку структуры BB с хорошим соответствием конструкции CAD были получены при использовании значений dZ и штриховки 3.8 и 1.7 мкм соответственно (1d).

Видео №1: пример печати BB.

Мощность лазера 85 мВт, dZ — 3.8 мкм и штриховка — 1.7 мкм были выбраны для производства микрокаркасов BB, которые в дальнейшем использовались в исследовании.


Изображение №2

Формы с V-образным дном для низкосвязывающей агарозы (C₁₂H₁₈O₉; 2а) были использованы для создания одиночных сфероидов hASC после 24 часов клеточного посева (2b и 2c). На лунку высевали 5000 hASC, поскольку такая плотность позволяла получать сфероиды диаметром примерно 300-350 мкм, что соответствует размеру BB структур.

Присутствие BB не препятствовало образованию сфероидов, так как клетки агломерировались внутри пористых микрокаркасов, подобно нормальным сфероидам (2c; видео №2 и №3).

Видео №2

Видео №3

СЭМ-анализ показал, что через день после посева клетки начали уплощаться, при этом несколько клеток округлой формы все еще присутствовали на поверхности сфероидной структуры. Типичные модели распространения клеток и филоподии были обнаружены при использовании более мощного увеличения. Сфероиды, сформировавшиеся внутри BB, обладали сходными с описанными ранее свойствами. Клетки полностью проникли в пористую сердцевину BB-структуры, и с помощью СЭМ были видны только распорки (2d и 2e).


Изображение №3

Далее было проведено исследование цитотоксичности. Тест экстракта оценивали с использованием преувеличенных условий. Во-первых, за счет использования большего количества BB / клеток, чем обычно требуется для образования сфероидов, и, во-вторых, за счет использования питательной среды, а также DMSO (диметилсульфоксид, C₂H₆OS) в качестве носителя экстракта (3a).

Анализ экстракта показал, что BB из светочувствительной PCL-смолы не оказывает влияния на монослой L-929 фибробластов, так как кинетика их роста, зарегистрированная в течение 21 дня эксперимента, не снижается в группе BB по сравнению с контрольной группой (3b). Кроме того, не было замечено различий в отношении распространения клеток между различными экспериментальными группами в ходе теста.

Также был проведен прямой анализ цитотоксичности на сфероидах, сформированных без (контрольная группа, называемая SPH) или с поддерживающими структурами BB (называемых BB; 3c), инкубированных в нормальной питательной среде. Количественное определение АТФ показало, что метаболическая активность SPH непрерывно снижалась с 1-го по 18-й день (3d). Аналогичная тенденция наблюдалась и для группы BB.

Дабы определить, является ли это падение метаболической активности связано с повышенной гибелью клеток, было проведено исследование жизнеспособности с использованием количественного анализа трипанового синего и окрашивания Live/Dead в разные моменты времени.

Жизнеспособность клеток в обеих группах (3е) была выше 90% в течение 34 дней эксперимента. Этот результат был подтвержден окрашиванием Live/Dead, выполненным на 3-й день (3f). Оба теста подтверждают, что потеря активности АТФ, описанная ранее, не связана с повышенной гибелью клеток.


Изображение №4

Следующий эксперимент показал, что не только метаболическая активность SPH хронологически уменьшалась, но и их максимальные диаметры Ферета (4а).

5000 агломерированных hASC сформировали сфероиды диаметром примерно 400 мкм, которые затем уменьшились до 300 мкм в течение 11 дней и достигали конечного диаметра 225 мкм через 28 дней (4а). А вот единицы ткани на основе BB хоть и начинали с такого же диаметра, но не демонстрировали подобного резкого его уменьшения. Их диаметр стабилизировался уже через 11 дней и достиг 320-335 мкм до самого конца эксперимента. Это значение немного больше, чем у исходно напечатанного BB (Ø = 300 мкм).

Наличие структур BB позволило ограничить уменьшение объема сфероидов, а также помогло сохранить лучшую округлость. Значения округлости составляли от 0.85 до 0.95 (где 1.0 соответствует идеальной сфере) для группы BB и только от 0.65 до 0.85 для SPH (4b). В условиях роста без прилипания hASC агломерировались и образовывали структуры SPH с большими отклонениями по размеру и форме, а также демонстрировали постоянное уменьшение диаметра с течением времени (4c и 4d).

Ученые отмечают, что 2PP позволяет производить не только сферические бакиболы, но и многие другие конструкции (такие как тетраэдры и кубы; 4e). Любопытно, что клетки внутри любой из этих форм образовывали компактные агломераты и ограничивались их объемом.


Изображение №5

В отсутствие BB структур наблюдалось, что многочисленные клетки непрерывно высвобождались из основных сфероидных тел в окружающую среду, что объясняет несоответствие формы и размера. Уменьшение размера и метаболической активности является прямым следствием уменьшения клеточной популяции. Проверка этого действительно показала уменьшение количества ДНК на сфероид для обеих групп, но простое присутствие BB позволяло поддерживать значительно более высокое количество клеток по сравнению с нормальными сфероидами SPH с 15-го по 32-й день (5а).

Для обеих групп была получена одинаковая эффективность посева 78% при сравнении количества ДНК, соответствующего клеточной суспензии 5000 hASC, депонированной в день 0 в каждой лунке. Из этого следует, что 22% клеток не интегрировались в формирующийся сфероид и оставались в супернатанте независимо от наличия или отсутствия микрокаркасов.

BB влияли не только на способность клеток к пролиферации (деление клеток), но и на секрецию ECM (внеклеточного матрикса) и уплотнение сфероидов. Количественный анализ ECM показал, что тенденция для обеих групп в отношении секреции белка одинакова: небольшое количество белка, секретируемого в течение первых 10 дней, затем значительное увеличение уже на 24 день (5b).

Интересно отметить, что количество белка, секретируемого на образец для SPH по сравнению с BB на 24-й день, существенно не отличается, если смотреть на средние значения, но есть сильное несоответствие в стандартных отклонениях. Выращивание сфероидов внутри BB стимулировало отложение ECM более воспроизводимым образом, чем при отсутствии BB. Поскольку количество ДНК на образец примерно в 5 раз выше в BB по сравнению с SPH для таких более поздних временных точек (5а), очевидно, что нормализация количества белка, секретируемого на ДНК (или на клетку), покажет значительно более высокие значения для SPH, чем для группы BB. Эта неоднородность с точки зрения отложения ECM для группы SPH подтверждает тенденции, наблюдаемые при анализе размера и округлости.

Различия в плотности клеток и отложении ECM также очевидны при просмотре поперечных сечений сфероидов. Анализ продемонстрировал, что клетки были однородно распределены по всему SPH (5c). Напротив, более низкая плотность упаковки, характеризующаяся многочисленными межклеточными полостями, наблюдалась уже через 1 сутки формирования BB сфероида (5d).

Ki-67 представляет собой ядерный белок, присутствующий во всех фазах клеточного цикла, кроме G0, и, таким образом, является маркером делящихся клеток. Иммуноокрашивание пролиферативного маркера Ki-67 показало, что количество клеток, подвергающихся делению, со временем значительно уменьшилось как для групп SPH, так и для групп BB (5e). Несмотря на то, что различия не были значительными, зональное перераспределение на 1-й день немного различалось между SPH и BB, где в центре сфероидов, культивируемых в микроскаркасах, наблюдалось больше делящихся клеток. Эта разница с точки зрения пространственного перераспределения стала значимой на 28-й день, поскольку в центре нормальных сфероидов SPH не было обнаружено клеток Ki-67 по сравнению с 9.3% для группы ВВ (5f и 5g).


Изображение №6

Чтобы оценить, может ли эта значительная разница иметь негативное влияние на поведение клеток, ученые провели анализ хондрогенной и остеогенной дифференцировки, сравнивая как SPH, так и BB с использованием hASC (изображение №6).

При хондрогенном состоянии (CM от chondrogenic condition) размер обеих групп эволюционировал одинаково и достиг через 4 недели культивирования среднего диаметра по Ферету 550 мкм и 563 мкм для SPH и BB соответственно. Это продемонстрировало, что присутствие микрокаркаса BB не препятствует росту клеток сквозь полимерную структуру и над ней (6a и 6b).

В конце культивирования для обеих групп не наблюдалось значительной гибели клеток (данные для BB показаны на 6c). Окрашивание альциановым синим на гистологических срезах и анализ DMMB подтвердили важные отложения ECM, богатые sGAG, без различий между обеими группами (6d и 6e).

Аналогичный эксперимент был проведен при культивировании hASC-сфероидов и BB в течение 4 недель в остеогенной среде (OM от osteogenic medium). В отличие от того, что наблюдалось для CM, образцы, размещенных в ОМ, уменьшались в размере с одинаковой тенденцией для обеих групп, даже если это было более выражено для сфероидов (уменьшение на 13% для BB против 30% для SPH). Из-за ограниченного клеточного роста распорки BB все еще различимы на СЭМ изображениях 4-недельных образцов, хранящихся в ОМ (6f). При этом жизнеспособность клеток сохранялась на хорошем уровне на протяжении всего эксперимента. Однако основное отличие при сравнении СМ и ОМ заключается в том, что клетки на поверхности SPH или BB проявляют более округлый фенотип для СМ по сравнению с более уплощенным фенотипом для ОМ (6f и 6g).

Все вышеописанные анализы и эксперименты были нацелены на оценку характеристик отдельных единиц. Далее ученые провели анализ того, как они будут вести себя, если их собрать вместе в одну макроструктуру. Так как основной целью использования BB является создание больших тканей, необходимо убедиться, что наличие микрокаркасов не препятствует слиянию.


Изображение №7

Используя 2 единицы (дуплеты), расположенные близко друг к другу, ученые показали, что группы SPH и BB могут эффективно сливаться в течение одного дня контакта (7a; интервальная съемка двух сливающихся SPH и BB показана на видео №4 и №5 соответственно).

Видео №4

Видео №5

Измерение межсферных углов подтвердило сходство кинетики слияния для обеих групп в первые трое суток эксперимента (7b). Несоответствие появилось в более поздние моменты времени, при этом θSPH превосходит θBB (210° против 170° соответственно). Это объясняется наличием BB, который физически сдерживает слияние 2 единиц в окончательную «продолговатую форму». Тем не менее, по мере слияния SPH происходили значительные морфологические изменения, при этом окончательный размер этого слитого дублета резко уменьшался по сравнению с первоначальными раздельными единицами (7a и 7c). В течение 3 недель культивирования уменьшение размера 2 слитых SPH было близко к 70% (7c).

Поскольку BB действует как «сфероидный экзоскелет», две соседние единицы могут соединяться из-за высокой пористости, но не могут полностью сливаться.

Далее ученые решили увеличить число BB единиц с двух до двадцати. Этот опыт подтвердил, что многоклеточные сборки могут формироваться и что присутствие микрокаркасов значительно снижает уплотнение ткани, происходящее при созревании (7d и 7e).

В каждый наблюдаемый момент времени уменьшение размера тканевой конструкции в результате самосборки 20 единиц было значительно более выраженным для группы SPH, чем для группы BB. Размер области уменьшился на 55% для SPH по сравнению с 17% для BB в течение 18 дней культивирования in vitro.

Несмотря на то, что размер тканей демонстрирует значительные различия в зависимости от присутствия или отсутствия BB, конечное количество клеток в этих тканях остается одинаковым. Количественная оценка ДНК, выполненная в конце периода культивирования (18 дней), выявила одинаковое количество для обеих групп, но с более равномерным распределением для BB, чем для группы SPH (7f).

Дополнительно было показано, что размер тканевой конструкции можно увеличить путем увеличения числа соединенных вместе BB. В результате можно получить ткань миллиметрового размера, что маловероятно в случае применения обычных сфероидных единиц (7g и 7h).

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые провели первую в мире полноценную оценку характеристик нового метода сборки клеток для тканевой инженерии (TERM). Ранее существовало два таких метода: каркасный и бескаркасный. Однако новый вариант предлагает использовать пористые сфероиды, которые внешне напоминают молекулу фуллерена.

Используя высокоточную 3D-печать на базе двухфотонной полимеризации (2PP) ученые создали микрокаркасы, внутри которых возможно размещение клеточных агломератов. Микрокаркасы, названные BB (от buckyball), защищают клетки от внешних механических повреждений. Кроме того, BB можно совмещать друг с другом, что позволяет создавать полноценные ткани большого размера, что ранее считалось практически невыполнимой задачей. Клетки внутри такой искусственной ткани не только сохраняют высокие показатели жизнеспособности, но и способны выполнять все свои основные функции.

В опытах ученые использовали стволовые клетки, которые можно применять для производства хрящевой или костной ткани. Другими словами, новая методика может сильно помочь в лечении различных травм и повреждений тканей и органов. Ученые же считают, что разработанные ими каркасы можно будет даже сделать инъекционными и использовать в малоинвазивной хирургии.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?