Когда человеку ставят какой-то серьезный диагноз, требующий операбельного вмешательства, то баланс ценностей смещается. Когда речь идет о выживании, то даже самый большой и страшный шрам меркнет на фоне потенциально летального дефекта, требующего инвазивного лечения. Однако, уже после операции многие пациенты, ставшие обладателями новых «украшений» на коже, сталкиваются с рядом проблем, не имеющим отношения к эстетике. Проблемы эти связаны с пониженной функциональностью участков, которые покрыты рубцовой тканье, а не полноценной кожей. Ученые из Имперского колледжа Лондона (Великобритания) разработали новую методику восстановления функциональности рубцовых тканей посредством трансплантации волосяных фолликул. В чем особенность методики, как она работает, и насколько она эффективна? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Фундаментальным явлением данного труда является ремоделирование тканей — реорганизация тканевой архитектуры, которая может быть как физиологической (т.е. отвечает за направление развития и поддержания тканей), так и патологической (т.е. после повреждения ткани). Во время заживления раны, вызванной повреждением кожи, клетки, мигрирующие в раневое ложе, откладывают массу грануляционной ткани, чтобы восстановить целостность барьера и предотвратить инфекцию. Затем новообразованная ткань ремоделируется для восстановления архитектуры и функции кожи. Хотя это патологическое ремоделирование может продолжаться в течение нескольких месяцев и даже лет, кожа никогда по-настоящему не восстанавливается до своего первичного неповрежденного состояния. В конце концов, большинство клеток в фиброзной ткани подвергаются апоптозу или мигрируют от места восстановления, оставляя за собой массу не полностью реконструированной ткани, известную как рубец (шрам).

Традиционные стратегии уменьшения образования рубцов включают разрезы по линиям Лангера, наложение глубоких швов для сближения краев кожи и повязки, снимающие напряжение с раны. В более современных методах задействуются лазеры, дермабразия, и микронидлинг. Однако данные методы больше косметические, нежели восстановительные.

Исследования молекулярных механизмов фиброза выявили несколько новых вариантов решения проблемы рубцов, которые были протестированы клинически. К сожалению, результаты оказались в значительной степени неутешительными. Эти подходы включают ингибирование цитокинов и факторов роста (PDGF, TGF-β1, CTGF)5, введение TGF-β3 и модулирование ангиогенеза.

После этих исследований стало ясно, что однокомпонентная терапия, основанная на секретируемых факторах или их ингибиторах, в значительной степени неэффективна из-за сложности процесса заживления раны и быстрой деградации белка в месте раны.

По мнению ученых, чтобы решить эту проблему, эффективная антифиброзная терапия должна быть основана на длительном воздействии множества факторов, чтобы вызвать устойчивый ответ, который ремоделирует фиброзную ткань до полной регенерации.

В отличие от не полностью реконструированной рубцовой ткани, здоровая кожа подвергается постоянному физиологическому ремоделированию, происходящему на стадии роста волосяного фолликула. Во время цикла волосяные фолликулы проходят стадии роста (анаген), регрессии (катаген) и покоя (телоген). В коже мышей фолликулы растут синхронно друг с другом, и поэтому целые участки кожи могут содержать волосяные фолликулы, которые одновременно полностью находятся в стадии анагена, катагена или телогена. В коже мышей, содержащей анагенные волосяные фолликулы, эпидермис, дерма и дермальная белая жировая ткань в 1.6-2.0 раза толще, чем эквивалентные слои кожи, содержащей телогеновые волосяные фолликулы. Несмотря на то, что дерма толще в коже с анагенными волосяными фолликулами, общее количество клеток в дерме такое же, как и в коже с телогеновыми фолликулами. Это наблюдение привело к предположению, что перераспределение внеклеточного матрикса (ECM от extracellular matrix) способствует изменению толщины кожи. Аналогичная параллель наблюдается с сосудистой сетью кожи — ангиогенез и обширная сеть кровеносных сосудов наблюдаются вокруг фолликулов в анагене, но они уменьшаются в катагене и телогене. В то время как цикличность волосяных фолликулов и ремоделирование межфолликулярной кожи четко связаны, механизм и степень, с помощью которой волосяные фолликулы могут регулировать ремоделирование, остаются неясными.

Вышеописанные наблюдения стали вдохновением для проведения рассматриваемого нами сегодня исследования. Ученые предположили, что анагенные волосяные фолликулы могут реконструировать зрелые рубцы на коже человека, подобно тому, как они реконструируют здоровые ткани кожи мышей.


Изображение №1

Потому было решено использовать обычную процедуру, проводимую в клиниках по пересадке волос, при которой анагенные волосяные фолликулы пересаживают в шрамы на коже головы, чтобы замаскировать безволосую фиброзную область, образовавшуюся в результате предыдущих операций по пересадке волос. На основе этой процедуры было в дальнейшем разработано клиническое исследование для проверки вышеописанной гипотезы (изображение №1).

Чтобы проверить, вызывается ли ремоделирование ткани анагенными волосяными фолликулами, трансплантированными в рубцы, ученые сравнили зрелую фиброзную ткань до (0 месяцев) и после (2, 4, 6 месяцев) трансплантации волосяных фолликулов и обнаружили сдвиг в сторону морфологии и генетического профиля здоровой кожи.

Результаты исследования

Стоит отметить, что стресс при трансплантации побуждает волосяные фолликулы вступать в катаген, за которым следует телоген и новый анаген. Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фолликулы повторно входят в анаген примерно через 60 дней после трансплантации и находятся в полном анагене через 90 дней после трансплантации.

В данном исследовании были взяты 3-миллиметровые пункционные биопсии рубцов до (точка времени 0 месяцев в качестве исходного уровня) и через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации волосяных фолликулов у 3 пациентов (1а). Фотографии в эти моменты времени показывают, что пересаженные волосяные фолликулы производят волосяные волокна к последующему периоду (1b). Дополнительно было проведено окрашивание срезов биопсии рубцов толщиной 10 мкм с использованием гематоксилина и эозина (H&E от haematoxylin & eosin). Было установлено, что все фолликулы уже находились в анагене через 2 месяца после трансплантации, подтверждая предыдущие наблюдения. Поскольку ученые считали, что анагенные волосяные фолликулы будут способствовать ремоделированию фиброзной ткани, они рассмотрели межфолликулярную ткань в биопсиях через 2, 4 и 6 месяцев и сравнили их с исходным уровнем.


Изображение №2

Эпидермальная функция нарушена в зрелых рубцах, которые склонны к разрывам из-за их тонкого эпидермиса и плоской базальной мембраны со сниженной экспрессией коллагена IV типа (COLIV). Вероятно трансплантация анагеновых волосяных фолликулов в зрелые рубцы может вызвать увеличение толщины эпидермиса и улучшить сцепление эпидермо-дермального соединения (EDJ от epidermal–dermal junction).

Чтобы проверить это, была проведена визуализация срезы рубцов толщиной 10 мкм до (0 месяцев) и через 2, 4 и 6 месяцев после трансплантации на минимальном расстоянии 200 мкм от пересаженных волосяных фолликулов, чтобы обеспечить тестирование межфолликулярной рубцовой ткани. Было использовано контрастное окрашивание ядер 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для отображения ядер клеток и измерения толщины жизнеспособного эпидермиса, который включает базальный, шиповатый и зернистый слои (2а).

В соответствии с увеличением толщины эпидермиса, наблюдаемым в коже мышей во время анагена, было обнаружено, что эпидермис рубца был в среднем в 1.6 раза толще всего через 2 месяца после трансплантации волосяного фолликула, в 1.4 раза толще через 4 месяца и в 2.0 раза толще через 6 месяцев после трансплантации по сравнению со зрелым рубцом до трансплантации (2b).

Это увеличение приводит к увеличению толщины эпидермиса примерно до 100 мкм, что аналогично наблюдаемому в здоровой коже затылочной части головы. Чтобы проверить, сопровождается ли увеличение толщины эпидермиса увеличением пролиферации клеток, срезы рубца окрашивали, чтобы обнаружить экспрессию Ki67 — маркера пролиферирующих клеток (2c).

Основываясь на данных испытуемых P1 и P2, было обнаружено в среднем 4% пролиферирующих клеток в исходном эпидермисе рубца, которые увеличились после трансплантации волосяных фолликулов до 9% через 4 месяца и 15% через 6 месяцев (2d).

Чтобы оценить влияние анагенных фолликулов, трансплантированных в зрелые рубцы, на EDJ, было использовано окрашивание на COLIV, присутствующее в базальной мембране (2e, 2f). Спустя 2 месяца не наблюдалось каких-либо изменений. EDJ увеличивалось через 4 и 6 месяцев по сравнению с исходным состоянием (2f). Толщину базальной мембраны и обилие COLIV определяли количественно на основе профиля интенсивности флуоресценции COLIV в EDJ (2f). В среднем наблюдалось 1.5-кратное увеличение толщины базальной мембраны чрез 2 месяца, затем 1.3-кратное через 4 месяца и 1.6-кратное через 6 месяцев (2i). Пиковая интенсивность экспрессии COLIV была выше через 2 (в 1.2 раза) и через 6 месяцев (в 1.2 раза) после трансплантации по сравнению с исходным уровнем (2j).

В совокупности эти результаты подтверждают гипотезу о том, что изначально тонкий эпидермис и плоская базальная мембрана зрелых рубцов претерпевают ремоделирование при трансплантации анагенных волосяных фолликулов.


Изображение №3

Стоит отметить, что дерма кожи содержит сеть плотных ECM, населенных клетками. После повреждений кожи, которые достаточно глубоки, чтобы разрушить корень волосяного фолликула, происходит накопление не полностью реконструированного ECM без волосяных фолликулов (т.е. рубец). Во время созревания рубца количество фибробластов уменьшается, что приводит к снижению плотности клеток дермы. Рубцовая ткань также характеризуется меньшим количеством кожного жира, возможно, вызванным отсутствием волосяных фолликулов, которые обычно стимулируют трансдифференцировку миофибробластов в адипоциты.

Чтобы проверить, может ли трансплантация анагеновых волосяных фолликулов в зрелые рубцы обратить этот процесс вспять, было использовано контрастное окрашивание ядер (DAPI) для визуализации ядер клеток в дерме в сочетании с визуализацией второй гармоники (SHG от second harmonic generation) для визуализации волокон коллагена типа I (COLI) (3а).

Плотность клеток дермы в зрелых рубцах после трансплантации фолликулов увеличилась в среднем в 1.8 раза через 2 месяца, в 1.5 раза через 4 месяца и в 2.0 раза через 6 месяцев по сравнению с исходным уровнем до трансплантации (3b). Это увеличение доводит плотность дермальных клеток примерно до 1000 клеток/мм², что соответствует плотности здоровой кожи затылочной части головы.

Морфологические изменения дермы после повреждений кожи также отражаются на степени васкуляризации. Капилляры, которые изначально формируются на пролиферативной стадии процесса заживления раны, дегенерируют во время ремоделирования, оставляя зрелые рубцы с низкой васкуляризацией.

Чтобы проверить, могут ли анагенные волосяные фолликулы, трансплантированные в зрелые рубцы, стимулировать ангиогенез, было проведено сравнение плотности сосудов до и после трансплантации волосяных фолликулов посредством окрашивания на коллаген типа IV (COLIV), присутствующий в базальной мембране кровеносных сосудов (3c).

Средняя плотность сосудов через 2 и 6 месяцев после трансплантации волосяного фолликула составила 10%, а спустя 4 месяца — 9%. Для сравнения в зрелом рубце этот показатель составляет 6% (3d). Средняя плотность сосудов в здоровой коже затылочной части головы составляет примерно 10%. Следовательно, данное наблюдаемое увеличение делает плотность сосудов близкой к той, которая наблюдается в здоровой дерме головы.

Результаты показывают, что трансплантация анагенных волосяных фолликулов в зрелые рубцы человека может обратить вспять снижение плотности клеток дермы и васкуляризации, которые происходят во время созревания рубца. В соответствии с ремоделированием эпидермиса, наблюдаемым после трансплантации волосяных фолликулов, эти результаты подтверждают гипотезу о том, что анагенные волосяные фолликулы могут вызывать длительные ремоделирующие изменения в фиброзной ткани.


Изображение №4

Рубцовая ткань состоит из не полностью реконструированного ECM, преимущественно состоящего из волокон COL1. Чтобы увидеть, могут ли анагенные волосяные фолликулы вызывать ремоделирование волокон COLI, была использована SHG микроскопия и метод анализа коллагена, основанный на интерактивном программном обеспечении для обучения и сегментации (ilastik).

Поскольку внеклеточный матрикс зрелого рубца состоит из большей плотности более толстых волокон COL1 по сравнению со здоровой кожей, анализ был сосредоточен на общей фракции коллагена и на доле толстых волокон. Было обнаружено среднее 1.3-кратное снижение общей фракции коллагена через 2 месяца, которое сохранялось через 4 месяца (1.6 раза) и 6 месяцев (1.5 раза) после трансплантации волосяных фолликулов (4а). Точно так же доля толстых коллагеновых волокон была первоначально снижена в среднем с 52% в зрелых рубцах до 46% через 2 месяца, до 39% через 4 месяца и до 35% через 6 месяцев после трансплантации (4b).

В зрелых рубцах, вместо нормального переплетения коллагеновых волокон, характерного для здоровой кожи, коллаген образует поперечные связи, которые индуцируют выравнивание в одном направлении, параллельном EDJ. В результате увеличения ориентации и плотности волокон жесткость дермы рубца увеличивается с 0.75 МПа неповрежденной кожи до 3 МПа при рубцевании.

Чтобы оценить ориентацию волокон в рубцах после трансплантации волосяных фолликулов, были созданы карты с цветовой кодировкой на основе SHG изображений, после чего был построен график ориентации волокон (4c).

Преимущественная ориентация волокон в зрелых рубцах параллельно эпидермису (при 0°) меняется уже через 2 месяца после трансплантации, когда коллагеновые волокна становятся более дезорганизованными, о чем свидетельствует снижение коэффициента выравнивания коллагена (4c) и более высокий разброс углов ориентации. Поскольку ткань с сильно выровненными коллагеновыми волокнами становится более жесткой при нагрузке, параллельной направлению волокон, редуцированная организация волокон в зрелых рубцах после трансплантации предполагает снижение жесткости ткани.

Уровень предварительного натяжения COLI волокон также может определять механические свойства кожи, влияя на ее способность сопротивляться деформации. Поэтому была использована интенсивность SHG сигнала в качестве прокси-меры натяжения коллагеновых волокон (4e). Анализ показал, что она уменьшилась в среднем в 1.2 раза (2 месяца), 2.1 раза (4 месяца) и 1.9 раза (6 месяцев) (4f). Эти результаты показывают, что снижение натяжения коллагеновых волокон дермы после трансплантации волос может привести к образованию фиброзной ткани, способной выдерживать более высокие нагрузки.


Изображение №5

Далее были проведены гистологические исследования, которые показали, что анагенные волосяные фолликулы, трансплантированные в зрелые рубцы кожи головы, вызывают морфологические изменения фиброзной ткани в сторону здоровой кожи. Чтобы идентифицировать паттерны экспрессии генов, лежащие в основе этой регенеративной характеристики, был проведен транскриптомный анализ с использованием Affymetrix на дерме кожи, выделенной из образцов 0, 2, 4 и 6 месяцев.

Используя консоль транскриптомного анализа, был выполнен однофакторный дисперсионный анализ набора данных и идентификация 719 генов, которые регулировались после трансплантации волосяных фолликулов в зрелые рубцы (5а). Иерархический кластерный анализ дифференциально экспрессируемых генов показал, что транскрипционные сигнатуры ремоделирования на более поздних стадиях (4 и 6 мес после трансплантации) наиболее сходны друг с другом (5a).

Чтобы идентифицировать транскриптомные изменения, происходящие в дерме рубца, ученые сравнили транскриптом рубца в каждый момент времени после трансплантации волос с исходным уровнем (0 против 2, 0 против 4, 0 против 6 месяцев), идентифицировав 270 генов, которые экспрессировались уникальным образом через 2 месяца, 242 гена через 4 месяца и 349 генов через 6 месяцев после трансплантации (5b).

Используя эти списки генов, был проведен анализ, основанный на выражении изменения кратности, с использованием программного обеспечения Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Анализ определил термины заболеваний и функций, которые имеют отношение к коже и имеют |activation z-score| > 0.5 (5c–5e).

Среди терминов, обнаруженных в рубцовой дерме после трансплантации, были выявлены транскрипты, участвующие в пролиферации фибробластов (5c и 5f), что объясняет гистологическое наблюдение повышенной плотности клеток дермы (3b). Активация терминов и транскриптов, участвующих в миграции эндотелиальных клеток сосудов (5d и 5g) и в ангиогенезе (5d и 5h), подтверждает обнаружение повышенной васкуляризации в рубцовой дерме после трансплантации волос (3d).

Помимо временных транскрипционных изменений в рубцовой дерме, происходящих в разные моменты времени после трансплантации, также имелась основная транскрипционная сигнатура, состоящая из 231 транскрипта, которые по-разному регулировались уже через 2 месяца после трансплантации и оставались такими на протяжении всего периода наблюдения (5b).

Ранее сообщалось о важности роли секретома волосяных фолликулов как в физиологическом, так и в патологическом ремоделировании кожи. Учитывая этот факт, ученые предположили, что волосяные фолликулы могут способствовать ремоделированию рубцов посредством паракринной передачи сигналов. Чтобы выявить изменения в цитокиновой среде зрелых рубцов после трансплантации волосяных фолликулов, ученые провели еще один анализ сигнатуры транскрипции (231 транскрипт) с использованием программного обеспечения IPA и выбрали все секретируемые регуляторы.

В результате было выявлено длительное ингибирование трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-β1), фактора роста гепатоцитов (HGF), интерлейкинов (IL-13, IL-6) и матриксной металлопротеиназы 12 (MMP-12) и активация IL-5 в рубцовой дерме после трансплантации волосяных фолликулов (5i).

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые провели детальный анализ влияния трансплантации анагенных волосяных фолликул на рубцовую ткань.

В совокупности результаты показали, что волосяные фолликулы в анагенном состоянии, пересаженные в зрелые рубцы, могут изменять фиброзную транскрипционную сигнатуру. Предсказанные изменения в цитокиновой среде фиброзной ткани демонстрируют сложность долгосрочного транскрипционного ответа в рубцах человека после трансплантации. В отличие от однокомпонентной антифиброзной терапии, вызывающей только временные изменения в выбранных молекулярных путях, волосяные фолликулы вызывают долговременное глобальное изменение транскриптома рубца, влияя на многие типы клеток и клеточные функции.

Это означает, что подобная процедура может оказывать положительное влияние на формирование здоровых тканей кожи на рубцовых участках. Наличие шрамов на коже человека сопряжено не только с эстетическими вопросами, которые в принципе можно игнорировать, но и физиологическими ограничениями, которые рубцовая ткань вызывает.

Ранее исследованные методы лечения шрамов акцентировали внимание на определенных факторах роста, которые должны были способствовать образование здоровых клеток и тканей кожи. В данном же труде было установлено, что трансплантация фолликул сопряжена с введением в рубцовую ткань сразу нескольких факторов роста, вызывающих обширную реконструкцию тканей вокруг. Изменения наблюдались не только на уровне архитектуры тканей, но и на генетическом.

Таким образом, данный труд показал, что самая обычная пересадка волос, которую часто считали косметической процедурой, может быть крайне полезна для послеоперационного восстановления пациентов. Самостоятельное заживление шрамов, которое никогда не достигает полноценной регенерации, занимает месяцы, а порой и годы. И весь этот период пациент может испытывать дискомфорт, снижение чувствительности, эластичности и прочности поврежденного участка и т.д. А потому желание избавиться от шрамов нельзя назвать прихотью во имя красоты, это вполне оправданная потребность.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?