Загрязнение окружающей среды является одной из самых болезненных проблем современности, поисками решения которой занимаются специалисты самых разных областей науки. Одним из главных источников загрязнения является пластик. Отказаться от столь полезного, но крайне неэкологичного материала мы не можем, так как альтернативы полноценной пока нет. Потому поиски методов переработки таких отходов крайне важны, особенно если эти методы позволяют не просто утилизировать мусор, но получить нечто полезное на выходе. Ученые из Канзасского университета (США) разработали новый метод переработки пластика в сырье для фармацевтики с помощью грибов. Как работает этот метод, какова роль грибов, и что можно получить после переработки? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Не хочется раздражать экологов, но нельзя отрицать тот факт, что пластик является крайне полезным, дешевым и удобным материалом. Он используется практически везде, от бытовых предметов до сложного лабораторного оборудования. Статистика говорит, что пластик на данный момент является лидером среди материалов по объемам производства, который к 2040 году может достичь 1.1 миллиона тонн в год. А вот переработка пластика не может похвастаться столь внушительной статистикой: в 2015 году было переработано всего лишь 9% пластика.

Пластик пластику рознь, в том плане, что некоторые типы пластика поддаются переработке лучше, чем другие. К примеру, полиэфиры перерабатываются чаще [около 30% полиэтилентерефталата (ПЭТФ)], чем полиолефины [около 6% полиэтилена низкой плотности (ПЭНП)].

Благодаря своей прочной микроструктуре и превосходным физико-химическим свойствам полиэтилены используются повсеместно, а потому ожидать полного отказа от использования этого материала в ближайшем будущем не стоит.

Помимо экологического аспекта существует еще и экономический. Дело в том, что даже в уже использованном пластике (т. е. пластиковом мусоре) есть вещества, которые могут иметь практическую пользу, если их правильно извлечь. Проблема в том, что те же физико-химические свойства, которые делают полиэтилены полезными, также препятствуют их разложению и переработке. Еще больше усугубляют эту проблему добавки, которые обязательно сопровождают любой поток отходов (красители, пластификаторы и т. д.).

В отличие от полиэфиров и нейлонов, известные химические методы переработки или повторного производства полиэтилена весьма ограничены. Некоторые из этих методов показали, что O₂ и оксид азота (NO) расщепляют полиэтилены до карбоновых кислот, нитратов и других оксигенатов при 170°C и 40 атм с общим выходом 65%.

Также исследуются и не содержащие окислителей каталитические подходы к вторичной переработке полиэтилена, включая метатезис алканов, гидрогенолиз и связанные с ними пути превращения полиэтиленов в легкие алканы. Хотя эти методы имеют скромный выход и являются весьма энергоемкими, они позволяют избежать потенциальных неконтролируемых реакций, которые могут возникнуть в результате нагревания органических веществ с O₂.

В последние годы ученые все больше начали уделять внимания методу биологической переработки отходов. Открытие ферментов, способных деполимеризовать ПЭТ, вызвало большой интерес как к разложению ПЭТ, так и к вторичной использованию продуктов этого разложения. Исследования показали, что есть возможность создавать полигидроксиалканоаты (ПГА) или родственные им продукты из субстратов пластика с помощью микробов. При этом ПГА, полученные из ПЭТ, могут быть преобразованы как в алкеновые кислоты, так и в углеводородное топливо. Чаще всего роль биологического компонента в этих методах играет бактерия E. coli (кишечная палочка). С ее помощью удалось преобразовать терефталевую кислоту, полученную из ПЭТФ, в различные ароматические соединения, включая галловую кислоту, катехол и ванилин.

Однако, в отличие от ПЭТ, для полиолефинов, таких как ПЭНП (полиэтилен низкой плотности) и ПЭВП (полиэтилен высокой плотности), методов биологической переработки существует очень мало. Следовательно, окончательного решения проблемы переработки ПЭТ, особенно биологической, пока нет. Потому ученые и решили провести рассматриваемое нами сегодня исследование, в котором основной акцент был поставлен не на бактериях, а на грибах.

В результате было показано, что полиэтилены могут быстро разлагаться с образованием субстратов, пригодных для модернизации в результате метаболизма грибов. В качестве доказательства концепции ученые показали, что эти субстраты, полученные из полиэтилена, можно использовать для производства различных вторичных метаболитов* (ВМ или SM от secondary metabolites) — апербензальдегида, цитреовиридина и мутилина.

Вторичные метаболиты* — органические вещества, синтезируемые организмом, но не участвующие в росте, развитии или репродукции.

Схема преобразования полиэтиленов в SM: полиэтилены химически разлагаются с использованием металлических катализаторов и кислорода под давлением с образованием распределения двухосновных кислот, которые метаболизируются грибами с быстрым образованием структурно разнообразных SM.

Результаты исследования

Адаптируя условия превращения циклогексана в адипиновую кислоту, ученые смогли оптимизировать исходную систему для расщепления полимера. Используя данные по потреблению кислорода и данные от ЯМР-спектроскопии, ученые подобрали оптимальные условия, основанные на солях кобальта и марганца и источнике NO на основе фталамида, которые дают необходимые результаты окислительного расщепления. Распределение продуктов α,ω-дикислоты, которые образуются в результате окислительной реакции, было дополнительно количественно определено с помощью ГХ-МС (газовая хромато-масс-спектрометрия).

Было замечено, что повторная загрузка реактора дополнительным O₂ не перезапустила реакцию расщепления полимера. Потому было предложено, что N-гидроксифталимид (NHPI от N-hydroxyphthalimide) служит источником NO, который удаляется из верхнего пространства реактора при повторной загрузке O₂. При инициировании реакции наблюдался быстрый гидролиз NHPI до фталевой кислоты.

Далее было замечено, что металлические катализаторы теряют реакционную способность в процессе повторной загрузки, и что лучший результат был получен, когда соли металлов добавлялись порциями вместе с O₂ и NHPI.

В условиях, оптимизированных для полной конверсии полимера в продукты с относительно небольшим содержанием двухосновной кислоты, наблюдалось извлечение 86 масс.% из 5 грамм образца чистого полимера.


Изображение №1

Исследуемый метод был проверен на четырех вариантах отходов (1A). Пластиковый пакет был гомогенизирован в двухосновные кислоты длиной C4–C12 с извлечением 34 масс.% с дополнительными 2% более длинных двухосновных кислот. Остальная часть материала состоит из разветвленных двухосновных кислот, полученных из ответвлений полимера, которые подходят для метаболизма грибов. Пластмассовая бутыль для молока и лабораторная емкость были гомогенизированы с извлечением 63 масс.% и 54 масс.%, соответственно.

Это давало распределение продуктов, как правило, большей массы, чем полиэтиленовый пакет (1B). Более высокое и более низкое извлечение объясняется различием ПЭВП и ПЭНП: бутыль для молока из ПЭВП не имеет полимерных ответвлений, которые не учитываются при расчете извлечения.

Как отмечают ученые, грибы представляют собой привлекательных кандидатов для модернизации дикислот из-за их устойчивости, низких экономических затрат на культивацию и способности синтезировать метаболиты с мощной и разнообразной биологической активностью. Однако сообщается, что дикислоты с короткой цепью ингибируют рост грибов.

Ученые подтвердили, что C4-C8 были токсичными для модельного мицелиального гриба A. nidulans (штамм FGSC A4), даже когда в качестве источника углерода присутствовала глюкоза. Однако было обнаружено, что A. nidulans использует двухосновные кислоты C10 и C12 в качестве единственных источников углерода без признаков токсичности. Потому была разработана система для отделения продуктов переваривания полиэтилена, содержащих ≥10 атомов углерода, от тех, что меньше 10 атомов. Серия жидкостных экстракций с контролируемым уровнем pH позволила быстро отделить двухосновные кислоты C10+ от легких двухосновных кислот и солей металлов.

В репрезентативном примере 27 масс.% полиэтиленов были преобразованы в двухосновные кислоты, которые можно было дискретно идентифицировать. Следует отметить, что легкие двухосновные кислоты не являются отходами. Они могут быть использованы для синтеза биоразлагаемого пластика. Дополнительный анализ этих кислот показал, что они обладают противогрибковыми свойствами, что также может быть использовано, к примеру, в фармацевтике.

Для получения SM из дикислот, полученных из полиэтилена, экстракт тяжелой дикислоты добавляли к жидким минимальным питательным средам в концентрации 10 г/л. Жидкие культуры инокулировали грибковыми штаммами и инкубировали в течение нескольких дней. SM анализировали и количественно определяли из культуральных экстрактов с помощью HPLC-DAD (от high-performance liquid chromatography with photodiode-array detection или высокоэффективная жидкостная хроматография с детектированием на фотодиодной матрице) и HPLC-DAD-MS.

Первоначальные попытки вызвать продуцирование SM из различных штаммов грибов дикого типа привели лишь к небольшому количеств SM, обнаруженному с помощью хроматографии. Потому было решено генетически изменить грибы A. nidulans для сверхэкспрессии генов биосинтеза SM или кластеров биосинтетических генов (BGC от biosynthetic gene cluster). И это дало отличный результат, обеспечив надежное и эффективное производство SM.

Чтобы определить универсальность системы, ученые попытались сконструировать штаммы грибов для производства различных типов SM, используя несколько подходов активации/экспрессии BGC. SM, использованный в качестве индикатора для первой из этих систем, представлял собой апербензальдегид — основной поликетидный промежуточный продукт в биосинтезе аперфуранона. Аспербензальдегид и его производные разбирают тау-филаменты, ингибируют липоксигеназы и ингибируют взаимодействие онкогенных РНК-связывающих белков HuR и Musashi-1 с их мРНК-мишенями. В результате было создано три штамма с различными системами для стимулирования производства аспербензальдегида: LO2955, LO8355 и LO10050.

В штамме LO2955 был обнаружен ген afoD, что блокировал биосинтез аперфуранона и приводил к накоплению апербензальдегида (биосинтетический предшественник аперфуранона). Кроме того, промотор гена afoA, который кодирует фактор транскрипции (AfoA), управляющий экспрессией BGC аспефуранона, был заменен промотором alcA (alcA(p)), который хорошо индуцируется различными спиртами и кетонами, включая метилэтилкетон.

Чтобы увеличить экспрессию AfoA, промотор гена alcR был заменен на промотор gpdA, в результате чего получился новый штамм – LO8355.


Изображение №2

Кроме того, была разработана новая промоторная система, использующая петлю положительной обратной связи (изображение №2). Эта система была включена в штамм LO10050. Такая система не требует индукции и должна вызывать сильную экспрессию на любом источнике углерода, тогда как система AlcA репрессируется рядом сахаров, включая глюкозу. Система положительной обратной связи предназначена для управления очень высокими уровнями транскрипции.

В дополнение к новой промоторной системе и делеции afoD, LO10050 также несет делеции всего стеригматоцистина BGC (гены AN7804-AN7825) и эмерицелламида BGC (гены AN2545-AN2549). Делеция этих сильно экспрессируемых BGC увеличивает пул предшественников SM, которые затем могут свободно использоваться для биосинтеза аспербензальдегида.

Выход каждого штамма, выращенного в жидкой среде с минимальным содержанием лактозы (LMM от lactose minimal media), определяли количественно с помощью HPLC-DAD. Каждый штамм давал значительный выход, но LO10050 показал самые высокие результаты (4.3 г/л из 15 г/л лактозы, или 29% массовой конверсии лактозы в аспербензальдегид). По этой причине этот штамм и был выбран для анализа продукции аспербензальдегида при расщеплении полиэтилена.

Чтобы определить общую применимость системы, ученые также попытались экспрессировать мутилин дитерпенового антибиотика из базидиомицета гриба Clitopilus passeckerianus и ингибитор β-субъединицы F1-ATPase цитреовидин из гриба A. terreus var. aureus.

Мутилин является промежуточным звеном в пути биосинтеза плевромутилина, который связывается с пептидилтрансферазным центром бактериальной рибосомы, тем самым останавливая синтез белка. Это делает мутилин крайне привлекательным в рамках изучения путей преодоления устойчивости бактерий к антибиотикам. Кроме того, базидиомицеты филогенетически далеки от аскомицетов, таких как A. nidulans, и способность продуцировать мутилин указывает на то, что эта система работает для BGC из сильно отличных друг от друга грибов.

Цитреовидин является мощным микотоксином, который ингибирует гидролиз и синтез АТФ путем связывания с β-субъединицей F1-ATPase. Соединения этого класса микотоксинов исследовались для лечения рака.

Всего четыре гена из A. terreus var. Aureus и пять генов из C. passeckerianus были перенесены в реципиентный штамм A. nidulans и помещены под контроль alcA(p) для получения надежных продуцентов цитреовиридина и мутилина соответственно.


Изображение №3

Созданные штаммы грибов инкубировали в жидких минимальных питательных средах с добавлением 10 г/л экстрактов гидролизата полиэтилена (PMM от polyethylene minimal media). Культуральные среды и/или мицелий экстрагировали соответствующими органическими растворителями, которые затем анализировали с помощью HPLC-DAD или HPLC-DAD-MS (графики выше).

Результаты анализа показали, что созданные штаммы грибов эффективно производили достаточные количества каждого целевого SM менее чем за одну неделю. Наблюдался обильный рост гиф (нитевидные образования грибов, подобные корням) уже спустя 48 часов инкубации, а спустя 72 часа образовывались крупные кристаллы аспербензальдегида.

Ученые отмечают, что стратегии метаболической инженерии, необходимые для придания грибам способности метаболизировать дикислоты, полученные из полимеров, не являются необходимостью. Вполне может хватить и простых протоколов экстракции для селективного выделения двухосновных кислот, подходящих для метаболизма грибов.

Также стоит отметить, что продукты разложения полиэтилена могут быть использованы в качестве источника углерода при производстве и других SM, помимо тех, что были представлены в исследовании. А факт того, что используемые BGC были получены из разных грибов, говорит о широком спектре источников BGC для такого типа переработки.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые продемонстрировали новый метод переработки полиэтиленовых отходов с применением грибов. В результате этой переработки можно не только избавиться от мусора, но и получить вещества, полезные для фармацевтики.

Основой процесса переработки является окислительный катализ, необходимый для получения распределений двухосновных кислот. Эти дикислоты быстро выделяются и улучшаются с помощью сконструированных штаммов A. nidulans для синтеза биоактивных SM (т.е. вторичных метаболитов). По словам ученых, в совокупности этот двухэтапный процесс значительно расширяет спектр продуктов, в которые могут быть переработаны полиэтилены.

Перед учеными было поставлено две задачи. Одна заключалась в попытке найти решение проблемы загрязнения мирового океана полиэтиленовым мусором. Другая — найти метод, позволяющий получить что-то полезное из переработки этого мусора. Разработанный ими метод успешно справляется с обеими задачами.

Проблема многих неэкологичных материалов заключается, как ни иронично, в их прочности и долговечности. Во время использования такие свойства очень полезны, но когда предмет становится мусором, то его «стойкость» становится проблемой для окружающей среды. Потому столь важно разрабатывать методы переработки таких материалов без необходимости менять их первичные свойства. А возможность получать после переработки полезные вещества, которые могут быть использованы в производстве других материалов или даже лекарственных препаратов, является дополнительным стимулом для бизнеса, который ранее считал процесс переработки экономически невыгодным.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?