Большинство живых организмов на планете в той или иной степени взаимосвязаны и участвуют в формировании пищевой цепи. Удаление какого-либо вида из этой цепи может привести к дисбалансу экосистемы с ее последующем увяданием. При этом существуют организмы, польза от которых весьма сомнительна. Речь, конечно же, о паразитах, многие из которых оказывают негативное влияние на определенные сферы деятельности человека. В попытках избавится от вредителей, мы используем разного рода химические вещества, которые могут нести потенциальный вред не только сельхоз культурам, но и здоровью человека. Ученые из университета Джонса Хопкинса (США) нашли более безопасный метод в борьбе с паразитическими насекомыми, основанный на контроле их популяции. Как именно ученым удалось получить контроль над рождаемостью насекомых, и насколько эффективен их метод? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Центральное место во многих регуляторных системах в природе занимают обратимые химические реакции, такие как ацилирование, гликозилирование, метилирование и фосфорилирование. Галогенирование также легко обратимо в биологических условиях, но редко используется для передачи сигналов, за заметным исключением гормонов щитовидной железы, тетра- и трийодтиронина. Наша потребность в йоде обусловлена исключительно биосинтезом этих гормонов, которые играют решающую роль в регуляции развития и метаболизма. Происхождение этой системы пока еще остается загадкой.

Обнаружение у Dictyostelium другой системы, основанной на галогенировании, также вызывает множество вопросов, при этом не имея связи с передачей сигналов щитовидной железы. Данный пример гораздо менее распространен и включает хлорирование и дехлорирование алкилфенона для регулирования образования стеблей.

Третий пример галогенирования связан с нейропептидом млекопитающих, содержащим бромтриптофан. Значение бромного заместителя остается неизвестным, поскольку его десбромпроизводное одинаково хорошо связывается с его рецептором. Бромированный триптофан был дополнительно обнаружен в некоторых конопептидных токсинах, и роль галогена еще предстоит определить.

В недавнем исследовании «Agonist Antibody Converts Stem Cells into Migrating Brown Adipocyte-Like Cells in Heart» учеными был изучен йодтирозин (I-Tyr), который является потенциальным регулятором. Авторы данного исследования описывают способность I-Tyr трансформировать морфологию CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток в морфологию адипоцитов. Однако полноценного описания передачи сигналов галогенированием у наземных многоклеточных животных пока еще нет.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученым удалось установить, что 3-бром-L-тирозин (Br-Tyr) у Drosophila melanogaster (дрозофила фруктовая) действует как модулятор сперматогенеза. Это открытие стало результатом не целевого скрининга низкомолекулярных эффекторов сперматогенеза, а скорее возможного подхода к изучению роли гомолога йодтирозиндейодиназы человека (IYD от iodotyrosine deiodinase) у дрозофилы. IYD является уникальным флавопротеином, который катализирует восстановительное дегалогенирование галотирозинов и был идентифицирован по его решающей роли в утилизации йода для синтеза гормонов щитовидной железы (1A). Гены, кодирующие гомологи IYD, присутствуют у широкого круга многоклеточных животных, а также у ограниченного числа бактерий и архей.

Ученые отмечают, что обширные знания и генетические инструменты, доступные для изучения дрозофилы, делают этот организм особенно привлекательным для определения функции IYD в организме, который, как известно, не требует йодида. Гетерологичная экспрессия гена condet (cdt, CG46438), представляющего гомолог IYD млекопитающих у дрозофилы, подтвердила, что кодируемый им белок (DmIYD) способствует восстановительному дегалогенированию in vitro. Селективность связывания и оборота DmIYD очень похожа на селективность IYD человека (HsIYD), а первичные последовательности их основной каталитической области идентичны примерно на 60%.

Особое внимание было обращено на сперматогенез дрозофилы из-за высокой экспрессии cdt в семенниках. Удаление cdt (группа cdt^Δ) или точечная мутация его активного сайта, ответственного за дегалогенирование (группа cdt^Q), ставит под угрозу фертильность дрозофилы. Используя масс-спектрометрию, генетику и микроскопию, удалось установить, что неправильная регуляция Br-Tyr вредна для индивидуализации сперматид, критического этапа спермиогенеза. Следовательно, данный процесс обеспечивает возможность контроля популяции не только дрозофилы фруктовой, но и других насекомых.

Результаты исследования

Изображение №1

Для проведения наблюдений и опытов были использованы 20 самцов дрозофилы после 6 дней спаривания. Галотирозины не были обнаружены выше пороговых значений, установленных с помощью комбинации обращенно-фазовой (C18) UPLC и масс-спектрометрии в экстрактах дрозофилы дикого типа (cdt⁺) с нормальными уровнями DmIYD (1B и 1D). Сюда входят Br-Tyr (< 1 пмоль/особь), Br₂-Tyr (< 0.2 пмоль/особь), I-Tyr (< 0.3 пмоль/особь), I₂-Tyr (< 0.2 пмоль/особь) и Cl-Tyr (< 2 пмоль/особь). Аналогичный анализ самцов cdt^Q, которые экспрессируют мутантный DmIYD с ~800-кратно меньшей активностью, выявил присутствие Br-Tyr в объеме 5.9 ± 1.1 пмоль/особь. Более того, самцы с нулевыми мутантами cdt^Δ накапливали еще больше Br-Tyr (9.4 ± 1.9 пмоль/особь). Br₂-Tyr (0.52 ± 0.09 пмоль/особь) также наблюдался выше предела обнаружения (0.2 пмоль/особь) у штамма cdt^Δ, но не у штамма cdt^Q. Остальные галотирозины в экстрактах обоих мутантных штаммов находились ниже пределов обнаружения.

Таким образом, Br-Tyr является родным для дрозофилы, но его можно обнаружить только тогда, когда дегалогеназная активность DmIYD либо нарушена, либо удалена. Конкретные гены, ответственные за стимулирование бромирования тирозина, еще не идентифицированы, но, вероятно, участвуют в биогенезе Br₂-Tyr, как только будет произведено достаточное количество Br-Tyr. Например, галопероксидазы, такие как тироидная пероксидаза, генерируют полигалогенированные материалы путем последовательного галогенирования тирозиновых и тирозильных остатков тиреоглобулина. Однако виды дрозофилы не содержат ортологов, которые, как было подтверждено, функционируют как тироидная пероксидаза или тиреоглобулин.

Предыдущие исследования показали, что ген cdt преимущественно транскрибируется в семенниках, а мухи с мутацией cdt имеют низкую фертильность, но субстрат для DmIYD еще не идентифицирован. Соответственно, семенники и оставшееся тело дрозофилы анализировали отдельно на наличие галотирозинов.

Опять же, у дрозофилы дикого типа (cdt⁺) моно- или дигалотирозин не был обнаружен. Почти равные количества Br-Tyr наблюдались в образцах семенников (2.6 ± 0.3 пмоль/особь) и тела (3.0 ± 1.5 пмоль/особь) мутантных мух (cdt^Q). Br-Tyr также был обнаружен на несколько более высоких уровнях в семенниках (3.7 ± 0.9 пмоль/особь) и тушке (4.4 ± 0.2 пмоль/особь) нулевого мутанта (cdt^Δ) по сравнению с теми, кто несет точечную мутацию cdt^Q. И снова Br₂-Tyr обнаруживался только у нулевого мутанта cdt^Δ, и аналогичные уровни присутствовали как в образцах семенников (0.24 ± 0.08 пмоль/особь), так и в телах (0.32 ± 0.04 пмоль/особь).

Предыдущие исследования скрещивания одного взрослого самца с одной взрослой самкой показали, что фертильность со временем снижалась как для (cdt^Q), так и для (cdt^Δ) мутантных штаммов. Ученые установили, что откладывание яиц не является источником этого эффекта, поскольку количество яиц было примерно одинаковым как в случае обычных мух, так и в случае мутантных штаммов.

Необходимость активного DmIYD для фертильности самцов затем была проанализирована путем последовательного спаривания самцов с тремя самками. В среднем в результате первого раунда спаривания между каждым самцом дикого типа (cdt⁺) и тремя самками дикого типа (cdt⁺) образовалось в среднем 116 ± 12 потомков (P_o) (1C). Однако это значение снизилось до 76 ± 8 на шестом раунде (P6) спаривания для каждого из исходных самцов и нового набора самок (cdt⁺).

Когда этот анализ проводился с использованием самцов-мутантов (cdt^Q), среднее потомство после первого раунда спаривания уменьшалось лишь незначительно (на 8%) по сравнению с контрольной группой особей дикого типа. Напротив, значительное снижение (на 53% у группы P6(cdt^Q) по сравнению с P6(cdt⁺)) было обнаружено на шестом раунде (день 6), что указывает на ухудшение выработки спермы у мутантных самцов cdt^Q с течением времени. Кроме того, самцы с нулевым мутантом cdt^Δ продемонстрировали еще более выраженное снижение фертильности (на 87%) на 6-й день. Затем самцов, использованных в этих экспериментах, препарировали для измерения присутствия галотирозина (1D). Выводом вышеописанных опытов является факт того, что снижение активности DmIYD приводит к накоплению Br-Tyr и Br₂-Tyr и, как следствие, снижению фертильности у самцов.

Снижение фертильности у самцов-мутантов cdt, вероятно, связано с дефектами индивидуализации сперматид. Сперматогенез D. melanogaster представляет собой жестко регулируемый процесс, состоящий из четырех раундов митотического деления зародышевых клеток в кистах зародышевой линии, каждый из которых инкапсулирован двумя соматическими клетками кисты. После последнего раунда митоза 16 сперматогониальных клеток внутри кисты вступают в мейоз с удлиненной профазой мейоза, называемой сперматоцитами. 16 сперматоцитов впоследствии вступают в два раунда мейотических делений, образуя 64 круглые сперматиды, которые вместе подвергаются элонгации и индивидуализации и становятся зрелыми сперматозоидами. Ранее уже было установлено, что транскрипция cdt максимальна в фазе G2 мейоза в сперматоцитах. Следовательно, любой Br-Tyr, вероятно, потребляется во время мейоза и/или более поздней фазы спермиогенеза, в ходе которой образуются зрелые сперматозоиды.


Изображение №2

У Drosophila testis описанный выше процесс происходит пространственно упорядоченным образом и может быть различен по клеточной морфологии и четким маркерам. Во время индивидуализации сперматид внутри каждой кисты зародышевой линии формируются 64 актиновых конуса, которые затем перемещаются в виде кластера вдоль аксонемы сперматозоида, образованной микротрубочками, с образованием отдельных сперматозоидов (обозначено стрелкой, 2A-2D). В семенниках с мутацией cdt^Q актин локализуется в дискретных областях, но демонстрирует неупорядоченный паттерн (2C) по сравнению с контрольными семенниками (2B). Этот фенотип более выражен в мутантных семенниках cdt^Δ (2D). Количественная оценка этого дефекта указывает на то, что 84% сборок актина в мутантных семенниках cdt^Δ аномальны (не конические) (2H). Удлинение сперматид также нарушено, о чем свидетельствуют неупорядоченные и запутанные сперматиды как в cdt^Q (2F), так и в мутантных семенниках cdt^Δ (2G) по сравнению с контрольной группой (2E).


Изображение №3

В последующем эксперименте участвовали самцы дикого типа, выращенные в стандартных условиях с добавкой Br-Tyr (1 мМ) для проверки корреляции между присутствием Br-Tyr и дефектами зародышевой линии, описанными выше. В этих условиях эндогенного DmIYD было недостаточно для разложения всего поступившего в организм Br-Tyr. При использовании этой добавки семенники штамма дикого типа (cdt⁺) содержали в среднем 6.9 ± 1.5 пмоль/особь Br-Tyr и 0.23 ± 0.03 пмоль/особь Br₂-Tyr (3A).

Тела самцов, выращенных с применением добавки Br-Tyr, содержали еще более высокую концентрацию этого соединения. Соответственно, мутантные самцы (cdt^Q и cdt^Δ) усиливали накопление Br-Tyr в соответствии с потерей дегалогенирующей активности. Потеря фертильности у самцов дикого типа (cdt⁺), получавших Br-Tyr, напоминает потерю, наблюдаемую у мутантных самцов cdt^Δ в отсутствие экзогенного Br-Tyr (1C и 3B). В обоих условиях потомство, полученное в результате шестого раунда спаривания, уменьшилось на ~ 85% (для обоих мутантов) по сравнению со штаммом дикого типа без воздействия экзогенного Br-Tyr.

Чувствительность самцов мух к Br-Tyr увеличивается у мутантов cdt, как и ожидалось, из-за их уменьшенной способности стимулировать дегалогенирование. Например, воздействие Br-Tyr на самцов-мутантов cdt^Δ сделало их практически стерильными к третьему раунду спаривания (3-й день) (3B).

Дефекты индивидуализации сперматид, выявленные у мутантных самцов cdt^Δ, были воспроизведены путем воздействия на самцов дикого типа экзогенного Br-Tyr. В обоих случаях F-актин демонстрировал дезорганизованные паттерны в отличие от дискретных конусных групп, видимых в семенниках самцов дикого типа, выращенных без воздействия экзогенного Br-Tyr (3C). При количественной оценке этого фенотипа большинство сборок актина не были коническими (≥ 80%) в семенниках мутантных самцов (cdt^Δ) и самцов дикого типа, обработанных Br-Tyr (3D), тогда как у самцов из контрольной группы этот показатель не превышал 3% (2H). Если же по отношению к самцам-мутантам cdt^Δ дополнительно применялся Br-Tyr (1 мМ), то отсутствие дискретных конусов в сборке актина было еще более выражено и достигало 98% (3D). Таким образом, количество накопления Br-Tyr в семенниках напрямую коррелирует со снижением мужской фертильности и дефектами индивидуализации сперматид.


Изображение №4

Избирательный ответ на Br-Tyr по сравнению с другими галотирозинами, возможно, не ожидался у дрозофилы, поскольку ни I-Tyr, ни Cl-Tyr не присутствуют в естественных условиях in vivo. Однако различные биологические последствия отдельных галотирозинов предполагают уникальную роль Br-Tyr как модулятора дифференцировки зародышевых клеток, а не общего нарушения клеточных функций, присущего всем галотирозинам. Замена добавок Br-Tyr на I-Tyr в исследованиях по кормлению была невозможна, поскольку I-Tyr высокотоксичен для дрозофилы из-за его способности подавлять биосинтез дофамина путем ингибирования тирозингидроксилазы. Напротив, Cl-Tyr в качестве добавки (1 мМ) переносится без осложнений.

Воздействие Cl-Tyr заметно снижало фертильность самцов уже на второй день наблюдений (4A). Однако эффект Cl-Tyr был значительно слабее, чем у Br-Tyr. На шестой день предварительное воздействие Cl-Tyr снизило фертильность самцов дикого типа менее чем на 50%, тогда как в случае применения Br-Tyr фертильность снижалась на 85% (1C и 3B). Фертильность самцов-мутантов cdt^Δ при использовании Cl-Tyr не сильно отличалось в случаях без применения Cl-Tyr (4B).

Далее ученые создали трансгенный штамм дрозофил с меченным эпитопом трансгеном cdt для пространственно-временной контролируемой экспрессии с использованием системы Gal4-UAS. Три тандемных повтора гемагглютининовой метки YPYDVPDYA (HA) были помещены в 5'-конце от трансгена (HA-cdt) для кодирования N-концевой метки HA на DmIYD для иммуноокрашивания в семенниках. Эта специфическая метка была выбрана на основе ее успешного слияния с более чем 3000 генами, кодирующими белки дрозофилы, без нарушения их биологической функции in vivo. Чтобы подтвердить активность DmIYD, меченного HA, этот белок (HA-DmIYD) экспрессировали в Escherichia coli и очищали с помощью стандартной Ni-аффинной хроматографии. Каталитическая эффективность HA-DmIYD по дегалогенированию как Br-Tyr, так и I-Tyr была аналогична эффективности использования немеченого DmIYD, экспрессированного в тех же условиях.


Изображение №5

Эксперименты были повторены, но с учетом DmIYD, который мог сверхэкспрессироваться в семенниках с использованием трансгена HA-cdt. Как и ожидалось, сверхэкспрессия трансгена зародышевой линии существенно не влияла на накопление Br-Tyr в теле самца по сравнению с контрольной группой без экспрессии трансгена. Напротив, экспрессия трансгена в зародышевой линии значительно снижала (в 7 раз) Br-Tyr в семенниках. В соответствии с этим уменьшением Br-Tyr мужская фертильность увеличилась. Например, трансгенные самцы (bam>HA-cdt), подвергшиеся воздействию Br-Tyr (1 мМ), неоднократно генерировали больше потомства, чем контрольные самцы без экспрессии трансгена (сравнение 3B и 5A). Штамм bam>cdt дал ~50 потомков после шестого раунда спаривания, тогда как контрольная группа в этих же условиях дала менее пяти потомков. Наконец, bam>HA-cdt также предотвращал снижение фертильности у мутантов cdt^Δ, выращенных на стандартной пище без добавки Br-Tyr (сравнение 1C и 5A). Таким образом, Br-Tyr, который накапливался в отсутствие эндогенного DmIYD, мог потребляться HA-DmIYD, контролируемым bam-Gal4, управляющим экспрессией трансгена на поздней стадии зародышевой линии.

Поддержание фертильности также отразилось в восстановлении нормальных актиновых групп. Организованная сборка происходила гораздо чаще, когда bam>HA-cdt экспрессировался в штамме cdt^Δ, чем в отсутствие этого трансгена (87% против 17%, 3D и 5B–5D). Таким образом, дегалогеназа DmIYD отвечает за удаление эндогенного Br-Tyr для правильной сборки актина и индивидуализации сперматозоидов. Кроме того, способность трансгенного HA-DmIYD устранять эффекты нулевого мутанта (cdt^Δ) подтверждает роль DmIYD в сперматогенезе.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученым удалось определить фермент из семенников, влияющий на фертильность самцов дрозофил. Получение контроля над этим ферментом позволяет контролировать заражаемость не только фруктовых мошек, но и других насекомых.

Ранее ученые обнаружили широкое распространение фермента йодтирозиндейодиназы, который играет важную роль в ключевых физиологических процессах некоторых бактерий, беспозвоночных и многих других организмов. В новом же исследовании было установлено, что этот фермент напрямую влияет на фертильность дрозофил. Подавление этого фермента приводит к перегрузке бромтирозина, естественной вариации обычной аминокислоты тирозина. Слишком большое количество этого соединения препятствует способности насекомого вырабатывать сперму.

Ранее ученые считали, что этот фермент характерен только для организмов, вырабатывающих тироксин, один из гормонов щитовидной железы, вырабатываемых всеми позвоночными животными, включая млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб. Задача фермента — поддерживать уровень йода в организме на здоровом уровне для выработки гормонов щитовидной железы, которые регулируют обмен веществ, рост и другие функции. Но обнаружение этого соединения в организмах, которые не являются позвоночными, стало неожиданным.

В ходе опытов ученые отключили специфический ген, кодирующий этот фермент, в результате чего в семенниках плодовых мух начинал накапливаться бромтирозин, что сильно снижает сперматогенез.

Авторы исследования утверждают, что их труд может стать основой для формирования методики по контролю за рождаемостью многих паразитических видов насекомых, которые вредят урожаю и/или являются переносчиками серьезных заболеваний, опасных как для людей, так и для других животных. Данный метод будет намного более экологичнее и безопаснее, так как не требует применения потенциально опасных химических соединений в качестве пестицидов.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?