Организм человека — это сложная, многоуровневая система, состоящая из множества подсистем, работающих в унисон. К сожалению, сбои в работе этой системы неизбежны. Воспалительный процесс внутри организма, особенно хронический, может иметь самую разную этиологию и приводить к самым разным малоприятным последствиям, от диабета до онкологии. Данный процесс запускается иммунной системой организма в ответ на те или иные повреждения или инфекции. Современная фармакология предлагает целый ряд средств, которые могут облегчить симптомы воспаления и нивелировать их первопричины. Помимо таблеток, микстур и прочей аптечной продукции, положительный эффект на воспаление могут оказывать определенные продукты питания и специи. Ученые из Токийского университета естественных наук (Япония) провели исследование, в котором установили, что для эффективной работы важно не количество потребляемых продуктов с таким эффектом, а их комбинация. Какие продукты и специи исследовались, каковы их эффекты, и какие комбинации оказались наиболее эффективными? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Воспаление — это фундаментальная физиологическая реакция, защищающая организм от инфекций и повреждений тканей. Однако при нарушении регуляции или длительном воспалении оно способствует развитию многочисленных заболеваний, включая атеросклероз, диабет 2 типа, ревматоидный артрит и рак. Среди участвующих иммунных клеток центральную роль играют макрофаги, высвобождающие провоспалительные цитокины и медиаторы, такие как оксид азота, фактор некроза опухолей α (TNF-α от tumor necrosis factor-alpha) и интерлейкин-6 (IL-6 от interleukin-6), особенно при стимуляции липополисахаридом (LPS от lipopolysaccharide). Поскольку эти медиаторы, продуцируемые макрофагами, вызывают как острое, так и хроническое воспаление, выявление факторов, регулирующих активацию макрофагов, имеет важное значение для понимания механизмов воспалительных заболеваний и разработки новых противовоспалительных стратегий.

Для экспериментального исследования этих процессов обычно используется мышиная макрофагоподобная клеточная линия RAW264.7 в качестве модели воспаления in vitro. Она обеспечивает воспроизводимую и биологически значимую систему для оценки воздействия биоактивных соединений на реакции, опосредованные макрофагами. Все больше внимания уделяется функциональным соединениям растительного происхождения, таким как флавоноиды (например, кверцетин, кемпферол), полифенолы (например, ресвератрол, куркумин) и терпеноиды, которые проявляют противовоспалительную активность, модулируя ключевые сигнальные пути, включая ядерный фактор каппа B (NF-κB от nuclear factor kappa B), митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK от mitogen-activated protein kinase) и ядерные рецепторы.

Также сообщалось о синергических взаимодействиях между фитохимическими веществами, приводящих к усилению подавления воспалительных медиаторов. Например, комбинированное лечение силибинином и дибензоилметаном оказывает синергический противовоспалительный эффект на стимулированные LPS клетки RAW264.7 путем модуляции путей NF-κB и HIF-1. Совместное введение цикориевой кислоты и лютеолина также ослабляет воспалительные реакции путем инактивации пути PI3K–Akt и нарушения ядерной транслокации NF-κB. Хотя такие результаты подчеркивают потенциал комбинированных фитохимических подходов, молекулярная основа этих синергических эффектов — в частности, как комбинации соединений модулируют внутриклеточные сигнальные сети в макрофагах — остается недостаточно изученной. Выяснение этих механизмов имеет решающее значение для рациональной разработки диетических или фармакологических соединений, направленных на борьбу с воспалением.

Чтобы восполнить этот пробел, ученые сосредоточились на соединениях растительного происхождения, которые активируют каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRP от transient receptor potential) и обладают противовоспалительными свойствами. Каналы TRP представляют собой семейство ионных каналов, играющих важную роль во многих физиологических процессах, включая модуляцию иммунитета. Они широко распространены в сенсорных нейронах, эпителиальных клетках и иммунных клетках, таких как моноциты и макрофаги. При активации различными стимулами, включая изменения температуры, механическое напряжение и химические раздражители, каналы TRP регулируют внутриклеточный уровень кальция и запускают сигнальные каскады, которые способствуют выработке провоспалительных цитокинов и хемокинов.

Несколько подтипов TRP — таких как TRPV1, TRPV4, TRPA1, TRPC3 и TRPM2 — участвуют в ключевых иммунных функциях, включая фагоцитоз, продукцию цитокинов и выживание клеток. Активация этих каналов может стимулировать сигнальные пути, такие как NF-κB, MAPK и JAK/STAT, что приводит к увеличению экспрессии IL-1, IL-6, TNF-α и IL-17. В отличие от них, TRPM8 и TRPC5 ассоциируются с противовоспалительными эффектами, что иллюстрирует контекстно-зависимый характер функции TRP-каналов в регуляции иммунитета.

Учитывая их широкую роль в иммуномодуляции, TRP-каналы привлекли значительное внимание как терапевтические мишени при воспалительных заболеваниях. Однако остается неясным, взаимодействуют ли и каким образом комбинации агонистов TRP-каналов растительного происхождения для модуляции воспалительных реакций макрофагов.

По этой причине в рассматриваемом нами сегодня труде ученые изучили противовоспалительные эффекты выбранных фитохимических веществ, включая агонист TRPV1 капсаицин (CA от capsaicin), агонист TRPA1 β-эудесмол (EU от eudesmol) и агонисты TRPM8 ментол (ME от menthol) и 1,8-цинеол (CI от cineole) — как по отдельности, так и в комбинации, используя стимулированные LPS макрофаги RAW264.7, с целью выяснения вклада TRP-зависимых и TRP-независимых сигнальных путей в их потенциальное синергическое действие.

Подготовка к исследованию

Культивирование макрофагов RAW264.7 и химическая обработка

Клетки RAW264.7 культивировали в стандартных 100-мм чашках для культивирования тканей в модифицированной среде Дульбекко (DMEM от Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), содержащей 30 мг/мл глутамина и дополненной 10% (об/об) фетальной бычьей сывороткой, пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл). Клетки поддерживали при температуре 37 °C во влажном инкубаторе с 5% CO₂ в течение 24 часов для прикрепления и стабилизации. Затем клетки собирали через 24 часа культивирования и высевали в 12-луночные планшеты с плотностью 5 × 10⁵ клеток на лунку в 1 мл полной культуральной среды, после чего инкубировали еще 24 часа для обеспечения адгезии и стабилизации клеток.

После этого инкубационного периода клетки либо подвергали анализу с помощью кальциевой визуализации, либо дополнительно обрабатывали в течение 24 часов, добавляя в культуральную среду диметилсульфоксид (DMSO от dimethyl sulfoxide) (конечная концентрация 0.1% (об/об)) вместе с l-ментолом (ME), 1,8-цинеолом (CI), β-эудесмолом (EU) и капсаицином (CA) в указанных концентрациях, как по отдельности, так и в определенных комбинациях. В качестве контрольного раствора использовали раствор, содержащий только 0.1% (об/об) DMSO.

Для оценки эффекта стимуляции липополисахаридом (LPS) клетки инкубировали с 1 мкг/мл LPS или без него в культуральной среде в течение 1, 3 или 6 часов. Применяли ряд ингибиторов/антагонистов, включая гидрохлорид N-(3-аминопропил)-2-[(3-метилфенил)метокси]-N-(2-тиенилметил)бензамида (AMTB) (7.5 мкМ), ингибитор канала TRPM8; A-967079 (20 мкМ), ингибитор канала TRPA1; и AMG9810 (10 мкМ), ингибитор канала TRPV1. Эти соединения добавляли за 2 часа до применения фитохимических веществ. Во всех экспериментах была включена контрольная группа без добавок, получавшая только культуральную среду.

Анализ жизнеспособности клеток

Клетки RAW264.7 предварительно инкубировали в течение 24 часов, а затем обрабатывали различными концентрациями фитохимических веществ (конечные концентрации: 1–500 мкМ) в течение дополнительных 24 часов. Затем клетки окрашивали пропидиум йодидом (1 мг/мл) и анализировали с помощью проточного цитометра.

Выделение РНК, синтез кДНК и количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР)

Общая РНК была выделена из клеток RAW264.7 с использованием реагента TRIzolR. Синтез первой цепи кДНК проводился из 0.5 мкг общей РНК с использованием набора ReverTra Ace qPCR RT Master Mix с gDNA Remover. Образцы РНК сначала инкубировали при 37 °C в течение 5 минут для удаления геномной ДНК, а затем проводили обратную транскрипцию при 37 °C в течение 15 минут. Количественная ПЦР (кПЦР) проводилась с использованием системы детекции ПЦР в реальном времени CFX Connect с THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix и ген-специфическими праймерами. Условия ПЦР-циклирования были следующими: начальная активация полимеразы при 95 °C в течение 60 с, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 с и отжига/удлинения при 60 °C в течение 30 с. Анализ кривой плавления проводился с использованием настроек прибора по умолчанию. Относительные уровни экспрессии генов рассчитывались после нормализации по референсному гену Gapdh.

Кальциевая визуализация

Уровень внутриклеточного кальция контролировали с помощью флуоресцентного индикатора кальция Fluo-4 AM. Клетки, культивируемые в 12-луночных планшетах, инкубировали в 1 мл среды DMEM, содержащей 1 мкМ Fluo-4 AM, при 27 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 1 часа. После инкубации среду заменяли на 1 мл среды DMEM, дополненной 1 мкМ иономицина в качестве положительного контроля, или фитохимическими веществами (100 мкМ EU или CA и 1 мМ ME или CI). Флуоресцентные сигналы регистрировали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (EVOS M7000 Imaging System) с возбуждением при 482/25 нм и эмиссией при 524/24 нм. Изображения получались с интервалом в 1 секунду.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Уровни TNF-α в культуральных супернатантах определяли с помощью коммерчески доступного набора Mouse ELISA MAX Deluxe Set для мышиного TNF-α в соответствии с инструкциями производителя. Кратко, клетки RAW264.7 обрабатывали, как описано выше, а культуральные супернатанты собирали и осветляли центрифугированием для удаления клеточного мусора. Планшеты для ELISA покрывали захватывающим антителом и инкубировали в течение ночи при 4 °C, после чего проводили блокирование с помощью прилагаемого блокирующего буфера. Затем в планшеты добавляли образцы и стандарты TNF-α и инкубировали при комнатной температуре. После промывки последовательно наносили детектирующее антитело и конъюгат авидин-пероксидаза хрена. Развитие окраски осуществляли с помощью субстрата тетраметилбензидина и останавливали добавлением стоп-раствора. Абсорбцию измеряли при 450 нм с коррекцией фонового сигнала при 570 нм с помощью микропланшетного ридера iMark. Концентрации TNF-α рассчитывали по стандартной кривой и выражали в пг/мл.

Статистика и воспроизводимость

Ученые провели однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Холма-Бонферрони или апостериорным тестом Тьюки (HSD) с использованием программы сравнения нескольких выборок. В случаях, когда данные не соответствовали предположениям для параметрического анализа, использовались соответствующие непараметрические тесты.

Результаты исследования

Эффективные дозы фитохимических веществ для подавления экспрессии гена TNF-α (Tnf), индуцированной LPS

Изображение №1

Для оценки противовоспалительной активности были измерены уровни экспрессии гена фактора некроза опухоли α (TNF-α) (Tnf), кодирующего ключевой провоспалительный цитокин, в клетках RAW264.7, предварительно обработанных растворами, содержащими ME, CI, EU или CA, с последующей стимуляцией LPS в течение 1 часа. Дозозависимые эффекты этих фитохимических веществ на экспрессию Tnf, индуцированную LPS, были оценены для определения их полумаксимальных эффективных концентраций (EC50), которые были рассчитаны как 62.17 мкМ для ME, 19.72 мкМ для CI и 31.41 мкМ для EU, что значительно выше, чем у CA (0.087 мкМ) (графики выше). Концентрации до 500 мкМ для ME и CI и до 100 мкМ для EU и CA не вызывали цитотоксичности в макрофагах. Эти результаты свидетельствуют о том, что наблюдаемое подавление экспрессии Tnf, индуцированной LPS, происходило при нецитотоксических концентрациях. Это указывает на то, что противовоспалительные эффекты не были обусловлены повреждением клеток.

TRP-зависимая и TRP-независимая регуляция экспрессии Tnf фитохимическими веществами

Изображение №2

Как говорилось ранее, исследованные в данном труде фитохимические вещества были идентифицированы как агонисты TRP-каналов. Чтобы определить, опосредуется ли эффект фитохимических веществ на LPS-индуцированную экспрессию Tnf в макрофагах RAW264.7 активацией TRP, ученые сначала отслеживали внутриклеточный приток Ca²⁺ при обработке фитохимическими веществами. Обработка ионофором Ca²⁺ иономицином вызывала пик внутриклеточного притока Ca²⁺ через 60 секунд (2A). Аналогично, обработка высокими концентрациями ME, CL или EU (100 мкМ или 1 мМ) индуцировала внутриклеточный приток Ca²⁺, тогда как CA этого не делал. Более низкие концентрации фитохимических веществ не давали обнаруживаемых флуоресцентных сигналов, вероятно, из-за пределов чувствительности этой системы. Эти результаты позволяют предположить, что ME, CL и EU обладают потенциалом активировать внутриклеточные сигнальные пути, опосредованные TRP, в клетках RAW264.7.

Далее было исследовано, зависят ли ингибирующие эффекты этих фитохимических веществ на экспрессию Tnf, индуцированную LPS, от специфических TRP-каналов в клетках RAW264.7. При обработке клеток гидрохлоридом AMTB, ингибитором TRPM8, ингибирующие эффекты ME и CI были полностью устранены, тогда как ингибиторы других TRP-каналов не влияли на их активность (2B). Аналогично, обработка A-967079, ингибитором TRPA1, устранила ингибирующий эффект EU. В отличие от этого, ни один из ингибиторов TRP, включая AMG9810 (ингибитор TRPV1), не устранил ингибирующий эффект CA. В совокупности эти результаты указывают на то, что ME и CI регулируют экспрессию Tnf зависимым от TRPM8 образом, EU действует через TRPA1, тогда как CA модулирует экспрессию Tnf независимо от любого из протестированных TRP-каналов, включая TRPV1.

Синергический противовоспалительный эффект ME или CI в комбинации с CA

Далее был изучен потенциальный синергический противовоспалительный эффект, возникающий при комбинации CA, соединения с удивительно низким значением EC50, с другими фитохимическими веществами. Клетки RAW264.7 обрабатывали смесями, содержащими либо 0.1 мкМ CA (приблизительно его концентрация EC50), либо в десять раз меньшую дозу (0.01 мкМ), вместе с различными концентрациями ME, CI или EU. Концентрации совместно применяемых фитохимических веществ были выбраны на основе их индивидуального дозозависимого эффекта и подтверждено, что они не являются цитотоксичными в используемых экспериментальных условиях. Затем оценивалось ингибирующее действие на экспрессию гена Tnf, индуцированную LPS. Примечательно, что ни 0.1 мкМ, ни 0.01 мкМ CA по отдельности не вызывали статистически значимого подавления экспрессии Tnf в клетках RAW264.7, стимулированных LPS. Однако совместное введение 0.01 мкМ CA с исследуемыми фитохимическими веществами привело к значениям EC50 36.56 мкМ, 13.09 мкМ и 18.50 мкМ для ME, CI и EU соответственно. Это соответствует приблизительно 1.7-, 1.5- и 1.7-кратному снижению по сравнению со значениями EC50, наблюдаемыми для каждого соединения при его индивидуальном применении (графики ниже).

Изображение №3

Более поразительно, что при одновременном применении с 0.1 мкМ CA значение EC50 EU снизилось в 4.9 раза. Эффекты были еще более выраженными для ME и CI, значения EC50 которых уменьшились в 699 и 154 раза соответственно (графики выше). Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что ME и CI проявляют мощный синергический противовоспалительный эффект при одновременном применении с CA в определенных концентрациях (т. е. 0.1 мкМ). Эти результаты согласуются с уровнями белка TNF-α в клетках, стимулированных LPS, после одновременного применения CA и ME, CI или EU (график ниже). Среди этих комбинаций наиболее эффективным оказалось одновременное применение CA и ME.

Изображение №4

Аналогичные синергические эффекты наблюдались и для другого провоспалительного гена, Il6. При одновременном введении с 0.1 мкМ CA значения EC50 для ME, CI и EU снизились в 28.3, 5.9 и 5.2 раза соответственно (графики ниже). Поскольку величина синергии была менее выраженной, чем та, которая наблюдалась для экспрессии Tnf, эти результаты предполагают, что синергические эффекты CA зависят от гена.

Изображение №5

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые систематически изучали противовоспалительные эффекты отдельных фитохимических веществ растительного происхождения на макрофагах RAW264.7, стимулированных LPS, уделяя особое внимание их комбинаторным взаимодействиям. Было установлено, что определенные комбинации фитохимических веществ оказывают выраженное синергическое противовоспалительное действие, в частности, приводят к ~700-кратному снижению значения EC50 для экспрессии Tnf при одновременном применении CA и ME. Это заметное повышение эффективности наблюдалось и для других комбинаций с участием CA и происходило без обнаруживаемой цитотоксичности. Таким образом, помимо существенного повышения эффективности, комбинации фитохимических веществ обладают преимуществом достижения сильного противовоспалительного эффекта при более низких эффективных дозах отдельных соединений, что может снизить риск побочных эффектов, связанных с применением высоких доз отдельных соединений. Механистический анализ также предполагает, что эта синергия возникает в результате интеграции TRP-зависимых сигнальных путей, активируемых ME, CI или EU, с TRP-независимым путем, активируемым CA. В совокупности эти результаты подчеркивают кооперативный механизм действия фитохимических веществ, который значительно усиливает противовоспалительные реакции в макрофагах и указывает на потенциальные преимущества комбинаций фитохимических веществ по сравнению с отдельными соединениями в борьбе с воспалением.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?