Весь мир — театр, а люди в нем актеры. Какой бы долгой или краткой не была пьеса, рано или поздно наступает финальный акт, поклон и занавес. Жизнь человека подобна вышеизложенному, и смертность присуща всем, независимо от образа жизни, состояния здоровья или гастрономических предпочтений. Помимо попыток отдалить неминуемый конец, важную роль играет то, как, а точнее в каком состоянии, его встречать. Одним из основных негативных эффектов старения является потенциальная потеря когнитивных функций, что разительно влияет на качество жизни человека. Научное сообщество многие годы пытается найти рецепт молодости, если не для всего тела, то хотя бы для мозга. Ученые из Техасского университета A&M (Колледж-Стейшен, Техас, США) кажется нашли его. Они создали назальный спрей, которой снижает воспалительные процессы и восстанавливает энергетические системы мозга, тем самым продлевая его «качественную» работу в рамках когнитивных функций. Из чего состоит чудо-спрей, как именно он работает, и каковы его перспективы в клиническом применении? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Эволюция, развитие технологий и науки привели к тому, что продолжительность жизни человека за последние тысячелетия сильно возросла. Ожидаемым, хоть и неприятным, последствием этого стало увеличение числа и частоты проявления возрастных заболеваний. В частности, нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Альцгеймера, стали одной из ведущих причин заболеваемости во всем мире. В связи с этим существует острая необходимость в разработке эффективных стратегий, способствующих успешному старению, при котором пожилые люди сохраняют более высокие когнитивные функции, продолжают активно участвовать в социальной жизни и демонстрируют минимальные проявления возрастных заболеваний.

Старение связано со снижением способности адаптироваться к новым стимулам и ухудшением когнитивных функций у значительной части людей. Исследования на животных моделях и посмертных образцах тканей мозга человека показали, что возрастные когнитивные нарушения часто связаны с различными неблагоприятными изменениями в головном мозге, особенно в гиппокампе. К возрастным изменениям относятся усиление окислительного стресса, митохондриальная дисфункция и нейровоспалительное старение. Нейровоспалительное старение представляет собой стерильное хроническое нейровоспаление умеренной степени, которое значительно усиливается у людей с нейродегенеративными заболеваниями. Оно характеризуется повышенными концентрациями активных форм кислорода (ROS от reactive oxygen species), связанными с митохондриальной дисфункцией, а также активацией нескольких провоспалительных сигнальных каскадов. К ним относятся активация инфламмасом NLRP3, а также пути cGAS-STING, приводящего к хронической активации сигнального пути интерферона I типа (IFN) в стареющем мозге.

NLRP3 преимущественно экспрессируется в микроглии — резидентных иммунных клетках головного мозга. Активация инфламмасом NLRP3 в микроглии молекулярными паттернами, ассоциированными с повреждением (DAMP от danger-associated molecular pattern; например, повышенным уровнем ROS), усиливает секрецию провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β (IL-1β) и IL-18. Эти цитокины способны индуцировать пироптоз соседних нервных клеток и активировать нижестоящий сигнальный путь p38 MAPK (от mitogen-activated protein kinase) через белок Myd88 (от myeloid differentiation primary response 88) и малую ГТФазу семейства Ras (от rat sarcoma virus). Данный процесс может способствовать формированию хронического нейровоспаления, сопровождающегося постоянным высвобождением повышенных концентраций различных провоспалительных цитокинов. В то же время активация пути cGAS-STING в микроглии, обычно запускаемая двуцепочечной ДНК (dsDNA от double-stranded DNA), высвобождаемой поврежденными клетками, приводит к усилению продукции интерферонов I типа (IFN-I), что далее активирует сигнальный каскад JAK-STAT (от Janus kinase / signal transducer and activator of transcription) с последующей транскрипцией многочисленных интерферон-стимулируемых генов (ISG от interferon-stimulated gene).

Таким образом, усиление окислительного стресса, митохондриальная дисфункция и хроническое нейровоспаление, опосредованное микроглией в стареющем мозге, повышают предрасположенность к развитию таких состояний, как умеренные когнитивные нарушения (MCI от mild cognitive impairment) и болезнь Альцгеймера. В связи с этим необходимы стратегии, способные ограничивать патологические воспалительные сигнальные каскады, опосредованные микроглией, для поддержания когнитивных функций и эмоционального состояния в пожилом возрасте. Однако методы лечения, способные эффективно подавлять подобные нейропатологические изменения, связанные с нарушениями памяти и когнитивных функций в позднем среднем и пожилом возрасте, до настоящего времени не разработаны.

Предыдущие исследования показали некоторые положительные эффекты трансплантации нейральных стволовых клеток (NSC от neural stem cell) в модели старения мозга и болезни Альцгеймера. Однако считается, что эффект трансплантации NSC обусловлен преимущественно паракринными эффектами (то есть побочным действием их секретома), включающего противовоспалительную, нейропротекторную и нейрорепаративную активность. С этой точки зрения внеклеточные везикулы (EV от extracellular vesicle), полученные из нейральных стволовых клеток человека, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-NSC-EV), которые сохраняют большую часть терапевтических эффектов родительских клеток, привлекли внимание как основа для разработки бесклеточных терапий. Кроме того, при интраназальном введении (IN от intranasally) hiPSC-NSC-EV эффективно достигают микроглии и астроцитов по всему головному мозгу и, как показано, индуцируют благоприятные транскриптомные изменения при таких состояниях, как болезнь Альцгеймера.

Более того, ранее было подтверждено, что содержащиеся в этих везикулах молекулярные компоненты (miRNA и белки) способны обеспечивать антиоксидантные, противовоспалительные и нейропротекторные эффекты в условиях in vitro и in vivo. В связи с этим в настоящем исследовании на мышиной модели было изучено, может ли интраназальное введение hiPSC-NSC-EV в позднем среднем возрасте существенно снижать окислительный стресс и подавлять микроглиально-опосредованное нейровоспалительное старение в гиппокампе.

Результаты исследования

Характеристики hiPSC-NSC-EV, использованных в исследовании

Изображение №1

Культуры hiPSC-NSC P11, использованные в исследовании, состояли исключительно из нейральных стволовых клеток (NSC), поскольку все клетки экспрессировали маркеры NSC — нестин и Sox-2 (1A). Внеклеточные везикулы (EV), выделенные из этих культур с использованием анионообменной и гель-фильтрационной хроматографии, имели средний размер 130.9 нм (1B). Эти везикулы характеризовались наличием специфических маркеров, включая тетраспанины CD63 и CD81, а также белок ALIX. При этом в их составе не обнаруживался цитоплазматический маркер кальнексин, присутствующий в hiPSC-NSC (1C). Дополнительно трансмиссионная электронная микроскопия подтвердила наличие в препаратах везикул, ограниченных двойной мембраной (1D). Ранее было показано, что различные белковые и miRNA-компоненты, переносимые этими EV, обладают антиоксидантными, противовоспалительными и нейропротекторными свойствами.

Биораспределение интраназально введенных hiPSC-NSC-EVs в мозге мышей позднего среднего возраста

Биораспределение интраназально введенных PKH-26-меченных внеклеточных везикул hiPSC-NSC-EV оценивалось в различных отделах головного мозга с использованием маркеров нейральных клеток через 6 часов после введения (1E, 1F) у самцов и самок мышей. Проведенный анализ показал, что hiPSC-NSC-EV проникали практически во все области мозга в течение 6 часов после введения. Во всех исследованных областях мозга везикулы обнаруживались в микроглии и нейронах. Также отмечалось взаимодействие EV с клеточными мембранами астроцитов и олигодендроцитов. Поскольку данное исследование сосредоточено на изменениях микроглии и астроцитов, индуцированных терапией hiPSC-NSC-EV, приведены примеры их проникновения в IBA-1+ микроглию, а также взаимодействия с плазматической мембраной сомы и отростков GFAP+ астроцитов в подрегионах гиппокампа (DG, CA1 и CA3) у самцов и самок мышей (1E, 1F). В целом, биораспределение интраназально введенных hiPSC-NSC-EV у мышей позднего среднего возраста соответствовало паттерну распределения, ранее наблюдавшемуся у молодых взрослых животных.

hiPSC-NSC-EV уменьшали гипертрофию астроцитов в гиппокампе

Изображение №2

Оценка морфологии GFAP+ астроцитов в гиппокампе показала, что степень гипертрофии астроцитов снижалась в группе животных, получавших EV в пожилом возрасте (aged-EV), по сравнению с контрольной группой (aged-Veh). Репрезентативные изображения из субполя CA3 гиппокампа у самцов и самок мышей из групп aged-Veh и aged-EV представлены на 2A–2D. Измерение площади GFAP+ астроцитарных элементов в гиппокампе с использованием ImageJ подтвердило, что как у самцов, так и у самок в группе aged-EV наблюдалось снижение выраженности GFAP+ структур по сравнению с контрольной группой aged-Veh (2E, 2F). Двухфакторный дисперсионный анализ (two-way ANOVA) выявил половые различия в степени астроцитарной гипертрофии в группе aged-Veh: у самцов уровень был выше, чем у самок. Однако анализ взаимодействия факторов пола и применения EV показал, что и самцы, и самки положительно реагировали на терапию EV. Таким образом, лечение hiPSC-NSC-EV в позднем среднем возрасте приводит к снижению гипертрофии астроцитов в стареющем гиппокампе.

hiPSC-NSC-EV снижали количество и кластеры микроглии в гиппокампе

Анализ распределения IBA-1+ микроглии в гиппокампе показал сопоставимую плотность микроглии в группе aged-EV по сравнению с группой aged-Veh. Репрезентативные изображения из субполя CA3 гиппокампа у самцов и самок мышей из групп aged-Veh и aged-EV представлены на 2G–2J. Стереологическая количественная оценка числа микроглиальных клеток на единицу объема гиппокампа подтвердила, что как у самцов, так и у самок в группах aged-Veh и aged-EV наблюдалась сопоставимая плотность IBA-1+ микроглии (2K–2L), что указывает на отсутствие влияния терапии EV на общее количество микроглии. В то же время анализ микроглиальных кластеров, представленных гипертрофированными клетками и рассматриваемых как признак микроглии, ассоциированной с патологическим состоянием, выявил их снижение в группе aged-EV по сравнению с aged-Veh. Репрезентативные примеры из молекулярного слоя зубчатой извилины у самцов и самок представлены на 2M–2P. Количественный анализ этих кластеров вдоль септо-темпоральной оси гиппокампа подтвердил, что у самцов и самок в группе aged-EV наблюдалось меньше микроглиальных кластеров по сравнению с контрольной группой aged-Veh (2Q–2R). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий ни в количестве микроглии, ни в числе кластеров, а также не обнаружил взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV. Таким образом, терапия hiPSC-NSC-EV в позднем среднем возрасте снижает выраженность фенотипов микроглии, ассоциированных с патологическим состоянием, в стареющем гиппокампе.

hiPSC-NSC-EV снижали окислительный стресс и усиливали NRF2 в гиппокампе

Изображение №3

Эффективность hiPSC-NSC-EV в снижении окислительного стресса оценивали по уровням маркеров окислительного повреждения (MDA и PC), основного регулятора антиоксидантного ответа NRF2, а также антиоксидантных ферментов (SOD и CAT). По сравнению с группой aged-Veh, у самцов и самок в группе aged-EV наблюдалось снижение концентраций MDA и PC (3A, 3B, 3F–3G), а также повышение уровней NRF2 и SOD (3C, 3D, 3H–3I). Концентрация CAT в группе aged-EV увеличивалась у самок (3J), но не у самцов (3E). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий в уровнях MDA, PCs, NRF2 и SOD между группами aged-Veh и aged-EV, а также не обнаружил взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV. Однако концентрация CAT оказалась полозависимой в группе aged-EV: у самок она была выше; а анализ взаимодействия показал, что положительный ответ на терапию EV наблюдался только у самок. Таким образом, терапия hiPSC-NSC-EV в позднем среднем возрасте снижает окислительный стресс в стареющем гиппокампе.

hiPSC-NSC-EV усиливали экспрессию генов митохондриальной дыхательной цепи в гиппокампе

Способность hiPSC-NSC-EV повышать экспрессию генов, связанных с митохондриальной дыхательной цепью, была исследована в гиппокампе, поскольку повышенный окислительный стресс повреждает митохондрии и нарушает работу дыхательной цепи. Анализ включал гены, ассоциированные с комплексом I (Ndufs6, Ndufs7), комплексом II (Sdha, Sdhb), комплексом III (Cyc1, Bcs1l), комплексом IV (Cox7b, Cox4i2) и комплексом V (Slc25a1, Atp6ap1) (3K, 3V). По сравнению с группой aged-Veh, у самцов в группе aged-EV наблюдалось значительное повышение экспрессии ряда генов, включая Ndufs6, Ndufs7, Sdha, Sdhb, Cyc1, Cox4i2, Slc25a1 и Atp6ap1 (3L–3P, 3S–3U). У самок в группе aged-EV наблюдалась аналогичная тенденция, однако статистически значимое повышение было отмечено для меньшего числа генов (Ndufs6, Ndufs7, Cyc1, Cox4i2, Slc25a1) по сравнению с aged-Veh (3W–3X, 3AA, 3AD–3AE). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий и взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV для большинства исследованных генов митохондриальной дыхательной цепи. Однако экспрессия Ndufs6 оказалась полозависимой в группе aged-EV: у самок она была выше, при этом анализ взаимодействия показал положительный ответ на терапию EV как у самцов, так и у самок. Таким образом, лечение hiPSC-NSC-EV у мышей позднего среднего возраста приводит к усилению экспрессии генов митохондриальной дыхательной цепи в стареющем гиппокампе.

hiPSC-NSC-EV подавляли активацию каскада инфламмасомы NLRP3 в гиппокампе

Изображение №4

Способность hiPSC-NSC-EV подавлять активацию инфламмасом NLRP3 оценивали по трем показателям: экспрессии связанных генов, включая Nlrp3, Pycard, Casp1, Il1β и Il18 (4A–4L); доле микроглиальных клеток, содержащих комплексы NLRP3–ASC (4M–4Z); уровню белков, участвующих в активации каскада, включая NF-κB p65, NLRP3, ASC, расщепленную каспазу-1, IL-18 и IL-1β (4AA–4AL).

По сравнению с группой aged-Veh, у самцов в группе aged-EV наблюдалось снижение экспрессии всех исследованных генов, при этом для Nlrp3, Pycard и Il18 снижение было статистически значимым (4B–4C, 4E). У самок в группе aged-EV выявлялась аналогичная тенденция, однако статистически значимое снижение отмечалось для Nlrp3 и Il18 по сравнению с aged-Veh (4H, 4K). Далее была оценена степень формирования инфламмасомных комплексов NLRP3–ASC в микроглии гиппокампа с использованием тройной иммунофлуоресценции (NLRP3, ASC и IBA-1) и Z-секционного анализа (4M–4Y). По сравнению с контрольной группой, как у самцов, так и у самок в группе aged-EV наблюдалось снижение доли микроглии, содержащей комплексы NLRP3–ASC (4S, 4Z).

Для подтверждения полученных результатов были измерены концентрации белков, участвующих в активации инфламмасомы NLRP3. По сравнению с группой aged-Veh, у самцов в группе aged-EV наблюдалось снижение концентраций всех исследованных белков, при этом для NF-κB p65, NLRP3, ASC и IL-18 снижение было статистически значимым (4AA–4AC, 4AE). У самок в группе aged-EV наблюдалась аналогичная тенденция, однако статистически значимое снижение отмечалось для NLRP3, ASC, расщепленной каспазы-1, IL-18 и IL-1β по сравнению с группой aged-Veh (4AH–4AL). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий между группами aged-Veh и aged-EV, а также взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV для всех исследованных генов и подавляющего большинства белков, связанных с активацией инфламмасомы NLRP3. Исключением стала концентрация NLRP3, для которой было выявлено взаимодействие между полом и терапией EV, однако как самцы, так и самки демонстрировали положительный ответ на лечение. Таким образом, терапия hiPSC-NSC-EV у мышей позднего среднего возраста существенно подавляет активацию инфламмасомы NLRP3 в стареющем гиппокампе. Этот эффект проявлялся снижением концентрации: транскрипционного фактора NF-κB p65, запускающего формирование инфламмасомных комплексов NLRP3; белков, обеспечивающих их активацию (NLRP3, ASC и расщепленная каспаза-1); и конечных продуктов активации инфламмасомы NLRP3 (IL-1β и IL-18).

hiPSC-NSC-EV снижали активацию сигнального каскада p38/MAPK в гиппокампе

Изображение №5

Поскольку конечные продукты активации инфламмасомы NLRP3 (IL-1β и IL-18), а также усиление окислительного стресса способны вызывать последующую активацию провоспалительного сигнального каскада p38/MAPK (5A), была исследована способность hiPSC-NSC-EV снижать концентрации белков, участвующих в активации сигнального пути p38/MAPK (Myd88, Ras, pMAPK и AP-1), а также некоторых конечных продуктов активации p38/MAPK (TNF-α и IL-18) (5B–5M). По сравнению с группой aged-Veh, у самцов и самок в группе aged-EV наблюдалось снижение концентраций всех исследованных белков, при этом для Myd88, Ras, pMAPK, AP-1 и TNF-α снижение было статистически значимым у обоих полов (5B–5F, 5H–5L). Концентрация IL-8 значимо снижалась у самок (5M), тогда как у самцов отмечалась лишь тенденция к снижению (5G). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий между группами aged-Veh и aged-EV по концентрациям Myd88, Ras, AP-1 и IL-8. Для pMAPK были выявлены половые различия: в группе aged-EV более высокие уровни наблюдались у самок. Концентрация TNF-α также демонстрировала половые различия — у самцов в группе aged-EV ее уровень в гиппокампе был выше. Однако post hoc анализ статистически значимых различий не выявил. Кроме того, не было обнаружено взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV ни для одного из белков, связанных с активацией p38/MAPK. Таким образом, терапия hiPSC-NSC-EV у самцов и самок мышей позднего среднего возраста предотвращала активацию провоспалительного сигнального каскада p38/MAPK в стареющем гиппокампе.

hiPSC-NSC-EV подавляли активацию пути cGAS–STING, а также нижестоящих сигнальных каскадов JAK–STAT и экспрессию ISG в гиппокампе

Изображение №6

Поскольку путь cGAS–STING и связанный с ним нижестоящий сигнальный каскад JAK–STAT (6A) являются одними из ключевых факторов возраст-ассоциированного воспаления как в периферических органах, так и в головном мозге, была исследована способность hiPSC-NSC-EV снижать концентрации белков, участвующих в активации сигнального пути cGAS–STING (p-cGAS, p-STING, p-TBK1 и p-IRF3), а также одного из его конечных продуктов — IFN-α (6B–6K). По сравнению с группой aged-Veh, у самцов и самок в группе aged-EV наблюдалось снижение концентраций всех исследованных белков, при этом для p-cGAS, p-STING и p-IRF3 снижение было статистически значимым у обоих полов (6B, 6C, 6E, 6G–6H, 6J). Концентрация p-TBK1 значимо снижалась у самок (6I), тогда как у самцов отмечалась лишь тенденция к снижению (6D). Концентрация IFN-α статистически значимо снижалась у самцов (6F), тогда как у самок наблюдалась только тенденция к снижению (6K). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий между группами aged-Veh и aged-EV по концентрациям p-cGAS, p-STING, p-TBK1 и IFN-α. Для p-IRF3 были выявлены половые различия: у самок в группе aged-EV наблюдались более высокие уровни этого белка. Кроме того, взаимодействие между полом и применением hiPSC-NSC-EV отсутствовало для большинства белков, связанных с активацией cGAS–STING. Исключением стала концентрация IFN-α, для которой было выявлено взаимодействие между полом и терапией EV, хотя положительный ответ на лечение наблюдался как у самцов, так и у самок. Таким образом, терапия hiPSC-NSC-EV в позднем среднем возрасте существенно подавляла активацию сигнального каскада cGAS–STING в гиппокампе стареющих самцов и самок мышей.

Поскольку повышенная продукция IFN-α может приводить к активации нижестоящего IFN-1-сигналинга через активацию белков JAK–STAT, была исследована способность hiPSC-NSC-EV снижать концентрации белков, участвующих в JAK–STAT сигнальном пути (p-JAK1, p-JAK2, p-STAT1 и p-STAT3) (6L–6S). По сравнению с группой aged-Veh, у самцов и самок в группе aged-EV наблюдалось статистически значимое снижение концентраций p-JAK2 и p-STAT1 (6M, 6N, 6Q, 6R). Концентрация p-JAK1 статистически значимо снижалась у самцов (6L), тогда как у самок отмечалась лишь тенденция к снижению (6P). Концентрации p-STAT3 не различались между группами aged-Veh и aged-EV у обоих полов (6N, 6R). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий между группами aged-Veh и aged-EV, а также взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV для всех исследованных белков, связанных с JAK–STAT. Таким образом, терапия hiPSC-NSC-EV в позднем среднем возрасте существенно подавляла активацию JAK–STAT-сигнального каскада, связанного с IFN-1-сигналингом, в гиппокампе стареющих самцов и самок мышей.

Далее было подтверждено снижение экспрессии отдельных ISG в гиппокампе как у самцов, так и у самок в группах aged-EV по сравнению с соответствующими группами aged-Veh. У самцов, получавших hiPSC-NSC-EV, наблюдалась подавленная экспрессия таких генов, как Icam1, Cd47, Irf5, Irf7, IFNγ и Tnf. В то время как у самок, получавших hiPSC-NSC-EV, снижалась экспрессия Icam1, Cd47 и Irf7.

hiPSC-NSC-EV, примененные в позднем среднем возрасте, улучшали когнитивные функции в старости

Изображение №7

Сначала было оценено, различаются ли уровни тревожности у животных групп Aged-Veh и Aged-EV с использованием теста открытого поля (OFT от open field test) (7A). Сравнение времени, проведенного в центральной зоне, и частоты заходов в нее показало сходное поведение у групп aged-Veh и aged-EV как у самцов, так и у самок (7B–7E). Таким образом, результаты когнитивных и поведенческих тестов не были обусловлены различиями в уровне тревожности между группами. Далее были исследованы распознавание объектов и пространственная память с использованием теста нового объекта (NORT от novel object recognition test) (7F) и теста расположения объекта (OLT от object location test) (7N). В NORT животные предпочитают исследовать новый объект (NO от new object) по сравнению со знакомым (FO от familiar object). В OLT животные предпочитают объект в новом месте (OINP от object in new place) по сравнению с объектом в знакомом месте (OIFP от object in familiar place). Первоначально было подтверждено, что отобранные самцы и самки действительно демонстрируют нарушения распознающей и пространственной памяти на момент вмешательства hiPSC-NSC-EV или Veh. Эти данные были получены на отдельных когортах животных, чтобы исключить влияние повторного поведенческого тестирования на результаты.

Далее была оценена когнитивная и мнестическая функция у животных групп aged-Veh и aged-EV в возрасте 19.5–20.5 месяцев (то есть начиная через 1 месяц после последнего введения Veh/EV). В тесте NORT (7F–7M) самцы и самки группы aged-Veh не демонстрировали предпочтения к исследованию нового объекта (NO) или знакомого объекта (FO) (7H, 7K), тогда как у животных группы aged-EV наблюдалось более длительное исследование нового объекта по сравнению со знакомым (7I, 7L). Представительные траектории движения животных из групп aged-Veh и aged-EV при исследовании FO и NO в третьей пробе (T3) NORT приведены на 7G.

В тесте OLT (7N–7U) животные группы aged-Veh предпочитали исследовать объект в знакомом месте (OIFP) по сравнению с объектом в новом месте (OINP) (7P, 7S), тогда как животные группы aged-EV демонстрировали предпочтение к исследованию OINP по сравнению с OIFP (7Q, 7T). Представительные траектории движения животных из групп aged-Veh и aged-EV при исследовании OINP и OIFP в T3 OLT приведены на 7O. Таким образом, самцы и самки группы aged-Veh демонстрировали нарушения формирования распознающей и пространственной памяти. В отличие от них, животные группы aged-EV проявляли сохраненную способность к распознаванию объектов и пространственной памяти. Это также подтверждалось значимо более низкими значениями NO/OINP-DI у самцов и самок группы aged-Veh по сравнению с группой aged-EV (7J, 7M, 7R, 7U). Двухфакторный ANOVA анализ не выявил половых различий между группами aged-Veh и aged-EV, а также взаимодействия между полом и применением hiPSC-NSC-EV для значений NO- и OINP-DI в NORT и OLT.

Нокдаун miR-30e-3p в составе hiPSC-NSC-EV снижал их способность ингибировать активацию NLRP3-инфламмасомы

Изображение №8

С использованием клеток RAW-ASC, трансфицированных геном мышиного ASC, была исследована способность hiPSC-NSC-EV подавлять индуцированную нигерицином активацию NLRP3-инфламмасомы (8A). Сначала было подтверждено значительное снижение уровня miR-30e-3p в EV, полученных из hiPSC-NSC, трансфицированных антагомирами, нацеленными на miR-30e-3p-5p. В этих EV экспрессия miR-30e-3p была снижена примерно на 79.61% по сравнению с EV из нативных hiPSC-NSC (8B). Подобного снижения не наблюдалось в EV, полученных из hiPSC-NSC, трансфицированных контрольным антагомиром. Схема экспериментального дизайна представлена на 8C.

Культуральная среда клеток RAW-ASC, обработанных нигерицином, характеризовалась повышенными уровнями IL-1β и IL-18 по сравнению с необработанными культурами (8D–8E). Добавление hiPSC-NSC-EV после обработки нигерицином значительно снижало уровни IL-1β и IL-18 по сравнению с группой, получавшей только нигерицин (8D–8E). В противоположность этому, добавление EV с дефицитом miR-30e-3p (KD-EV) не приводило к снижению уровней IL-1β и IL-18 по сравнению с группой нигерицин, получавшей только нигерицин. Аналогичные результаты были получены при измерении IL-1β и IL-18 в клеточных лизатах (8F–*8G). В совокупности эти результаты указывают, что miR-30e-3p является ключевым активным компонентом hiPSC-NSC-EV, ответственным за ингибирование активации NLRP3-инфламмасомы.

Нокдаун miR-181a-5p в составе hiPSC-NSC-EV снижал их способность ингибировать активацию STING

С использованием клеток RAW-Lucia-ISG было исследовано, как hiPSC-NSC-EV подавляют активацию STING, индуцированную 2’,3’-cGAMP (8H). Сначала было подтверждено значительное снижение уровня miR-181a-5p в EV, выделенных из hiPSC-NSC, трансфицированных антагомирами против miR-181a-5p. В этих EV экспрессия miR-181a-5p снижалась примерно на 72.81% по сравнению с EV из нативных hiPSC-NSC (8I). Подобного снижения не наблюдалось в EV, полученных из hiPSC-NSC, трансфицированных контрольным антагомиром. Схема экспериментальных этапов представлена на 8J.

Культуральная среда клеток RAW-Lucia-ISG, обработанных 2’,3’-cGAMP, характеризовалась повышенной активностью люциферазы по сравнению с необработанными культурами (8K). Добавление hiPSC-NSC-EV после обработки 2’,3’-cGAMP значительно снижало активность люциферазы по сравнению с группой, получавшей только 2’,3’-cGAMP. В противоположность этому, добавление EV с дефицитом miR-181a-5p (KD-EV) не приводило к снижению активности люциферазы по сравнению с группой 2’,3’-cGAMP. Аналогичные результаты были получены при измерении уровней IFN-α в лизатах клеток RAW-Lucia-ISG: 2’,3’-cGAMP вызывал значительное повышение IFN-α, тогда как добавление нативных hiPSC-NSC-EV снижало его уровень, а KD-EV эффекта не оказывали. В совокупности эти результаты указывают на то, что miR-181a-5p является ключевым активным компонентом hiPSC-NSC-EV, ответственным за ингибирование активации STING.

Взаимодействие с hiPSC-NSC-EV вызывало масштабные транскриптомные изменения в микроглии стареющего мозга

Изображение №9

Анализ данных scRNA-seq показал, что на t-SNE-графиках не наблюдалось четкого разделения между группами aged-Veh и aged-EV. Анализ дифференциально экспрессируемых генов (DEG) выявил 896 генов с повышенной экспрессией и 2025 генов со сниженной экспрессией в группе aged-EV по сравнению с aged-Veh (9A). KEGG-анализ обогащения (KEGG Mouse 2019) показал распределение DEG по 71 сигнальному пути, включая болезнь Альцгеймера, окислительное фосфорилирование, сигнальные пути TLR, MAPK и TNF, C-тип лектиновых рецепторов, а также сигнальные пути mTOR, FoxO, Notch и Rap1, и путь убиквитин-опосредованного протеолиза (9B). Анализ DEG, картированных на эти пути, выявил повышение экспрессии ряда генов, связанных с болезнью Альцгеймера, причем значительная их часть относилась к митохондриальной функции. Особенно важно, что все гены, связанные с окислительным фосфорилированием, были значительно повышены в группе aged-EV по сравнению с aged-Veh, что указывает на усиление митохондриальной активности после лечения EV в позднем среднем возрасте (9C, 9D).

Изображение №10

Кроме того, терапия hiPSC-NSC-EVs модулировала транскриптом микроглии в ключевых воспалительных путях: в сигнальных путях TLR, MAPK, TNF и C-тип лектиновых рецепторов значительная часть DEG была снижена в группе aged-EV, что указывает на ослабление нейровоспалительной сигнализации (10A–10D). Также наблюдалось снижение экспрессии множества DEG в путях, связанных с долголетием, включая mTOR-, FoxO- и Notch-сигнальные пути (10E–10G). Дополнительно было выявлено снижение экспрессии генов в сигнальных путях Rap1 и убиквитин-опосредованного протеолиза после терапии hiPSC-NSC-EV у стареющих мышей (рис. S7A, B).

Изображение №11

Также был выполнен анализ кластеров микроглии на основе DEG между кластерами, в результате чего было выделено пять различных кластеров (11A). KEGG-анализ сигнальных путей DEG кластеров 1–5 показал их участие в множестве путей, включая связанные с нейровоспалением. Среди них DEG кластера 1 были обогащены по TLR сигнальному пути. Экспрессия генов Pik3cd и Map3k8 в этом микроглиальном кластере была значительно снижена при воздействии hiPSC-NSC-EV (11B). DEG кластера 2 были связаны с сигнальным путем IL-17 и метаболизмом холестерина. В IL-17-сигналинге экспрессия генов Lcn2, S100a8 и S100a9 была значительно снижена в микроглии группы aged-EV по сравнению с aged-Veh. Одновременно экспрессия генов, связанных с метаболизмом холестерина, включая Ldlr и Lpl, была значительно повышена в группе aged-EV (11C, 11D). DEG кластера 4 были связаны с сигнальными путями IL-17, NOD-подобных рецепторов и Rap1 (11E–11G). В сигнальном пути IL-17 экспрессия Lcn2, S100a8 и S100a9 была снижена в группе aged-EV (11E). В сигнальном пути NOD-подобных рецепторов экспрессия Gbp2, Oas1a и Oas1g была повышена, а Camp снижена в группе aged-EV (11F). В сигнальном пути Rap1 экспрессия Adcy8 и Thbs1 была снижена, тогда как Flt1 и Igf1 были повышены в группе aged-EV (11G). Таким образом, кластерный анализ выявил модуляцию провоспалительных сигнальных путей и процессов метаболизма холестерина в микроглии после воздействия hiPSC-NSC-EV.

Далее был выполнен анализ GeneWalk, в результате чего была получена диаграмма рассеяния, основанная на связях генов и доле релевантных GO-терминов (11H). Были выделены наиболее значимые гены с числом связей > 100 и наибольшей долей релевантных GO-терминов (1:00). Среди них экспрессия генов Nrf1, Sec24C и Fos была снижена в микроглии группы aged-EV по сравнению с группой aged-Veh (11H). Эти гены играют важную роль в активации провоспалительных процессов в микроглии. Поэтому снижение их экспрессии согласуется с ослаблением нейровоспаления в группе aged-EV. Кроме того, экспрессия гена Nfe2l1 была повышена в группе aged-EV, что является значимым, поскольку Nfe2l1 участвует в поддержании редокс-баланса за счет активации антиоксидантных генов и поддержания митохондриального гомеостаза. Таким образом, анализ GeneWalk также подтвердил снижение провоспалительного транскриптомного профиля микроглии после лечения hiPSC-NSC-EV.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

Старость неизбежна, но как именно ее проводить — вопрос открытый. Качество жизни человека пожилого возраста зависит от множества физиологических изменений, вызванных старением. Нарушение или ухудшение работы мозга является одной из самых неприятных и сильно влияющих на жизнь особенностей старения. Авторы рассмотренного нами сегодня труда нашли решение этой проблемы. Они разработали специальный назальный спрей, который разительным образом улучшает работу мозга у стареющих мышей.

Терапия основана на микроскопических биологических частицах, называемых внеклеточными везикулами (EV от extracellular vesicle). Эти крошечные структуры естественным образом транспортируют генетический материал между клетками. В данном случае они были загружены микроРНК — молекулами, которые помогают регулировать важные биологические процессы в головном мозге. Назальный спрей, как форма доставки препарата, позволял обойти защитный барьер мозга и доставлять препарат непосредственно в его ткани. Попав в мозг, препарат воздействовал на иммунные клетки, участвующие в хроническом воспалении. По словам исследователей, терапия подавляла воспалительные системы, такие как инфламмасома NLRP3 и сигнальные пути cGAS-STING, которые тесно связаны с возрастным воспалением мозга.

Ученые также обнаружили, что препарат не только уменьшал воспаление, но и восстанавливал активность митохондрий — крошечных структур внутри клеток, ответственных за выработку энергии. Старение и воспаление могут повреждать митохондрии, делая клетки мозга менее эффективными и более уязвимыми к деградации. Улучшение функции митохондрий, по-видимому, помогает клеткам мозга восстановить способность обрабатывать и хранить информацию.

Поведенческие тесты на подопытных мышах показали, что обработанные особи значительно лучше справлялись с задачами на память и распознавание. Они были более успешны в идентификации знакомых объектов, распознавании новых и обнаружении изменений в окружающей среде по сравнению с необработанными контрольными группами. Одной из самых значимых находок стало то, что эффект от препарата проявился быстро и сохранялся в течение нескольких месяцев после всего двух доз.

Авторы разработки уверены, что их творение может стать высокоэффективной заменой инвазивных процедур и/или многомесячного препараторного лечения. Конечно, это не эликсир молодости в своем классическом смысле, но что есть молодость, если не ясность ума.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?