Моя гениальная подруга Адаоби Адибе прислала мне научную работу о придании прозрачности биологическим тканям. В публикации «Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules» учёные достигают этого — в частности на примере куриной грудки — за счёт погружения материала в раствор тартразина. Тартразин — это яркий жёлто-оранжевый пищевой краситель, используемый в чипсах Doritos.

Мы планируем провести ещё более амбициозный эксперимент. Но в качестве разминки я попытался воспроизвести некоторые части этого протокола, вымочив куриную грудку именно в растворе тартразина. Мне удалось добиться частичной прозрачности, но не в той степени, которую достигли авторы исследования. Образец на фото ниже — это кусочек куриной грудки толщиной около 2 мм, который я отрезал от слайса 5 мм, вымоченного в растворе тартразина ~0,19 М в течение 12 часов при комнатной температуре. Снимок сделан при свете настольной лампы. По нему видно, что сквозь ткань просвечивают линии сетки. Сама же ткань курицы, хоть и осталась на ощупь такой же, визуально стала напоминать мармеладных мишек.

В работе авторы использовали раствор с концентрацией 0,62 М при температуре 40 °C и механический шейкер. Но я не нашёл способа для безопасного повторения этих условий, да и оборудования у меня подходящего не было. Пришлось реализовать свою версию протокола исследования.

Фото ниже сделано уже под другим углом. Слева образец из раствора тартразина, а справа — контрольный, который вымачивался в воде (он немного пожелтел, так как сам процесс довольно маркий, и на него случайно попала пыль красителя).

В верхней части образец частично прозрачен, и под ним виднеется сетка с ячейками 5 × 5 мм. Как я уже сказал, визуально он стал похож на мармеладные конфетки. Так и хочется его зажевать, если бы не риск подхватить сальмонеллу.

Мне не хотелось налипнуть на иск от Doritos за нарушение авторских прав, поэтому вот вам карикатурная инструкция о том, где можно раздобыть тартразин. 

Как это работает?

В текущей модели этот эффект объясняется тем, что поглощающие свойства тартразина изменяют показатель преломления воды. Приближая этот показатель к показателю преломления белково-липидного раствора, мы делаем объект более прозрачным. Позже я поясню более подробно.

Протокол

Я взял тартразин от APC Pure. Содержание красителя в нём составляло >80%, что создаёт некоторую неопределённость в итоговой молярности растворов. На его основе я приготовил два раствора разной концентрации, а в качестве контрольного использовал чистую воду:

• тартразин: 0 г, водопроводная вода: 20 г, массовая доля: 0%, моляльность (моль/кг воды): 0, тартразин (ммоль): 0, молярность (прибл.): 0 М (контроль);

• тартразин: 2 г, водопроводная вода: 18 г, массовая доля: 10%, моляльность (моль/кг воды): 0,21, тартразин (ммоль): 3,7, молярность (прибл.): ~0,19 M;

• тартразин: 6 г, водопроводная вода: 14 г, массовая доля: 30%, моляльность (моль/кг воды): 0,80, тартразин (ммоль): 11,2, молярность (прибл.): ~0,56 M.

Молярная масса тартразина составляет 534,4 г/моль. При расчёте количества вещества я использовал номинальную массу (а поскольку в порошке содержится >80% красителя, истинные значения могут оказаться примерно на 15% ниже). Молярность рассчитывалась исходя из объёма итогового раствора ~20 мл.

Ниже показано, как выглядела упаковка тартразина, и перечислены его характеристики. У него нет запаха, а FDA относит эту пищевую добавку к безопасным для здоровья, поэтому на данном этапе я надевать перчатки не стал.

• Продукт: Tartrazine E102 FG, C.I. 19140

• Содержание красителя: >80%

• Молекулярная формула: C16H9N4Na3O9S2

• Молекулярный вес: 534,37 г/моль

• λmax (в воде): 425 нм

• Вещества, нерастворимые в воде: <0,20%

• Побочные красители: <1,00%

• Тяжёлые металлы (в пересчёте на свинец): <40 мг/кг

Для подготовки раствора я взвесил необходимое количество компонентов на ювелирных весах и добавил воду до достижения массы, указанной в таблице.

Тартразин я размешал в воде стеклянной палочкой при комнатной температуре до исчезновения видимых комочков.

Ниже показаны три раствора с разной концентрацией — самый концентрированный слева, по центру средней концентрации и контрольная вода справа.

В качестве экспериментального материала я взял филе грудки от компании Tesco. Сначала я отрезал один слайс толщиной 5 мм и уже от него три кусочка примерно по 15 мм.

После я погрузил каждый из этих кусочков в свою ёмкость с раствором.

Первые результаты после 6 часов замачивания

Начнём с того, что эксперимент с самым концентрированным раствором провалился, так как тартразин, похоже, кристаллизовался. Ниже видно, как это выглядело — образовалась сплошная корка.

В растворе средней концентрации (~0,19 M) кусок грудки обрёл желатиновый вид, но прозрачным не стал. Контрольный образец остался полностью непрозрачным.

Все эти образцы я в итоге выкинул и попробовал следующий метод.

Вторая попытка — замачивание 12 часов

На сей раз я решил следовать похожей процедуре и замочить грудку также при комнатной температуре, но уже на 12 часов. Учитывая прошлый нюанс с высокой концентрацией (~0,56 М), я оставил только средний и контрольный растворы. А поскольку образцам предстояло аж 12 часов находиться при комнатной температуре, из соображений пищевой безопасности я решил поместить их в пробирки и дополнительно накрыть.

Результаты

На камере это плохо видно, но теперь образец из раствора со средней концентрацией стал слегка прозрачным в сравнении с контрольным.

Для более тщательной проверки я положил его под настольную лампу.

Затем я нарезал образцы на ломтики толщиной примерно 2 мм. Возиться с маленькими скользкими кусочками было довольно неудобно. Вот как эти ломтики выглядели в сравнении. 

Зачем вообще пытаться сделать курицу прозрачной?

Эту технику уже применяют для облегчения процесса прижизненного имиджинга (оптическое наблюдение процессов на уровне органов и тканей).

В моей сфере успешное освоение этого метода позволило бы расширить возможности независимых учёных при проведении домашних экспериментов. Благодаря ему исследование внутреннего строения тел стало бы более тривиальной задачей. Придание тканям прозрачности позволило бы получать более качественные снимки для подробного изучения их структуры.

Одним из направлений моего исследования является эффективное наблюдение при минимальных затратах. В прошлом посте я рассказывал о создании программы для отслеживания броуновских частиц с помощью микроскопа. Я также подумываю об измерении концентрации углекислого газа с помощью давления. При достижении достаточной точности такой способ окажется намного дешевле. В этом смысле я невероятно рад возможности пробовать странные и крутые методики, которые облегчают исследование различных структур!

Как краситель делает биологическую ткань прозрачной?

Впереди вас ждёт целый подробный экскурс в тему оптической прозрачности.

Непрозрачность материала определяется двумя его свойствами. Во-первых, он может поглощать свет и блокировать его. Во-вторых, из-за разницы в показателях преломления он может свет рассеивать.

Причина непрозрачности: поглощение

Начнём с того, что световые лучи при прохождении сквозь объект могут поглощаться его веществом. Если свет поглощается, он не достигает наших глаз, и то, что находится позади объекта, мы не видим. Кроме того, свет может состоять из волн разной длины, и то, какие именно длины волн материал поглощает, определяет его спектр. Чтобы рассчитать этот спектр, мы можем примерно приравнять физическое поведение молекул к поведению электрона в потенциальной яме. Если вспомнить уравнение Шрёдингера, то оно показывает, что такая система может обладать лишь дискретными значениями энергии, и указывает, какие именно это значения. Разница между этими уровнями энергии и задаёт длины волн, которые в конечном итоге поглощаются материалом.

В реальности объекты состоят из разных веществ, поэтому поглощают волны разных длин.

Вторая причина непрозрачности: преломление

Ещё одна причина непрозрачности объектов уже менее очевидна, зато более интересна. Показатель преломления вещества указывает, как быстро через него проходит свет. Когда свет переходит из вещества с одной преломляющей способностью в вещество с другой, он слегка отклоняется. Если материал состоит из множества веществ с разными показателями преломления, то из-за постоянного отклонения на границах этих веществ лучи начинают хаотично метаться и рассеиваться.

И примером такого материала как раз являются биологические ткани, которые содержат волокна, клетки, белки и другие компоненты. Каждое из этих веществ имеет свой показатель преломления. А когда вещество с одним показателем оказывается внутри вещества с другим, возникает рассеяние. В результате свет, проходящий через объект, искажается. Схематично весь этот процесс показан ниже.

Биологические ткани можно представить как состоящие из комплекса веществ: водной основы с вкраплениями липидов и белков. Все эти вещества имеют разные показатели преломления.

Как же тогда сделать объект прозрачным?

Для этого потребуется правильно воздействовать на две описанные причины непрозрачности. Первый подход — это попытаться изменить спектр поглощения материала так, чтобы уменьшить диапазон поглощаемых им волн.

Второй вариант (который и будет описан ниже) — это попытаться изменить показатель преломления воды так, чтобы он сравнялся с показателями остальных внутренних структур. Далее этот принцип описан на примере биологических тканей. Изменяя с помощью красителя показатель преломления воды, мы приближаем его к аналогичному показателю белков и липидов, у которых он изначально немного выше.

Если вам удастся проделать это без изменения поглощающих свойств материала, то материал должен стать прозрачным.

А как повлиять на показатель преломления?

Итак, задача ясна — нужно изменить показатель преломления. Вот вам карта вычислений, которые помогут понять, как это реализовать.

Чтобы увидеть, какую роль показатель преломления играет в математической модели, мы представим распространение света с точки зрения уравнений Максвелла. Свет — это электромагнитная волна, состоящая из колеблющихся электрического и магнитного полей. Для понимания основной сути мы здесь сосредоточимся только на электрической составляющей.

Используя комплексное представление и рассматривая распространение света вдоль оси z в вакууме, мы можем записать его следующим волновым уравнением:

Но для удобства мы используем комплексные числа:

Здесь E₀ — это амплитуда напряжённости поля, ω — это угловая частота (в фиксированной точке поле совершает один полный цикл каждые T = 2π/ω, c — это скорость света, z — это расстояние вдоль луча, а t — время. Расстояние от пика до пика волны выражается как λ = 2πc/ω.

Перевод:

Однако при распространении света в среде мы ожидаем изменения его скорости света, а также частичное поглощение. Перепишем уравнение:

Коэффициент n′ в экспоненте выступает множителем перед пространственным членом и представляет действительную часть показателя преломления. Величина κ отражает степень затухания волны и характеризует поглощение.

На практике мы можем объединить n′ + iκ в одно число и назвать его комплексным показателем преломления.

Прежде всего, нам нужно попробовать изменить действительную часть этого показателя. Если удастся повысить преломление воды до уровня окружающей ткани, мы получим более прозрачный материал. У воды его значение составляет 1,33. И хотя эта цифра может меняться, у структур, богатых белками и липидами, она достигает примерно 1,45. Так что вся задача сводится к тому, чтобы приблизить показатель преломления воды к 1,45, что и сделает общий материал прозрачнее.

В процессе манипуляций с водой нужно быть осторожными, чтобы попутно не задрать её показатель поглощения. Если κ окажется слишком высок, то весь свет будет просто поглощаться, и никакой прозрачности мы не получим.

Так как же изменить показатель преломления? Чтобы ответить на этот вопрос, сначала нужно разобраться в принципе поляризации. Говоря простым языком, любое вещество состоит из электронов, связанных с атомными ядрами. Когда на вещество воздействует электрическое поле, взаимное расположение электронов и их ядер меняется.

Для каждой пары положительно и отрицательно заряженных частиц поляризация выражается как величина их заряда, умноженная на расстояние смещения этих частиц относительно друг друга. Чтобы рассчитать это значение, нужно построить модель, описывающую, насколько далеко электроны смещаются от ядра под действием электрического поля.

Вычисление поляризации материала

Электрические поля воздействуют на свободные заряды. Чтобы описать влияние электрического поля на вещество, мы примем положительное ядро за неподвижную точку, а электроны будем считать подвижными. Для расчёта поведения этой системы мы воспользуемся моделью осциллятора Лоренца.

В этой модели электроны рассматриваются как упруго связанные с ядром (подобно грузику на пружине с затуханием), а электрическое поле выступает в качестве внешней вынуждающей силы:

Второй закон Ньютона для электрона в световом поле, колеблющемся с частотой ω, записывается так:

Если мы предположим, что электрон колеблется на частоте поля, и в качестве рабочей гипотезы возьмём его координату как x(t) = x₀ e^(−iωt), то получим следующее выражение, описывающее его положение относительно ядра:

Дипольный момент выражается как p = −ex, а при N электронов в единице объёма его поляризация вычисляется как:

В этой схеме ω₀ представляет собственную частоту связанного электрона — то есть ту, на которой молекула поглощает свет (для тартразина это пик на длине волны 425 нм). Величина γ — это коэффициент затухания, от которого зависит ширина пика поглощения. А ω — частота самого электрического поля. Теперь, когда поляризация нам известна, нужно связать её с показателем преломления. Для этого придётся провернуть пару математических трюков с двумя тождествами.

По общепринятому соглашению поляризацию можно записать как величину, пропорциональную напряжённости электрического поля:

Здесь ε₀ — это электрическая постоянная, χ — диэлектрическая восприимчивость (безразмерная величина, показывающая, насколько легко поляризуется материал), а E — напряжённость электрического поля. Сравнивая это выражение с результатом, полученным выше для осциллятора Лоренца, получим:

Связь поляризации с показателем преломления

Чтобы связать полученные поляризацию и диэлектрическую восприимчивость с показателем преломления, мы используем следующий приём. Приведённое ниже доказательство я получил с помощью ИИ и проверил вручную.

Эта степень поляризации и электрическое поле определяют величину под названием вектор электрического смещения D. При этом связь между D и напряжённостью электрического поля линейна, а коэффициент их пропорциональности называется относительной диэлектрической проницаемостью, εᵣ. P означает поляризацию единицы объёма и представляет собой средний индуцированный дипольный момент всего материала.

Получается, что относительная диэлектрическая проницаемость связана с комплексным показателем преломления следующим соотношением:

Доказательство этой связи для обычной электромагнитной волны классическое — я привёл его ниже в сноске.¹ Таким образом, чтобы скорректировать комплексный показатель преломления, нужно изменить относительную диэлектрическую проницаемость материала.

Для дальнейших расчётов я буду использовать аппроксимацию. Вектор электрического смещения напрямую зависит от поляризации материала. Но если смешать два компонента, то их плотности поляризации можно просто сложить.

До добавления тартразина поведение чистой воды описывается так:

Затем после добавления красителя получаем:

Но нам известно, что поляризация каждого компонента пропорциональна напряжённости поля и обладает собственной восприимчивостью: P(воды) = ε₀ χ(воды) E и P(тартразина) = ε₀ χ(красителя) E, где χ(красителя) — это восприимчивость красителя. Подставив эти значения, получим:

Если сравнить это с выражением D = ε₀εᵣE и учесть, что для чистой воды εᵣ(water) = 1 + χ(water) = n(water)², то относительная диэлектрическая проницаемость подкрашенной воды будет равна:

Для раствора красителя величина χ(красителя) мала по сравнению с n(воды)². Поэтому для получения изменённого показателя преломления воды после добавления красителя можно извлечь квадратный корень и использовать разложение в ряд Тейлора.

Величина n_c комплексная. И если мы запишем её в виде n_c = n′ + iκ и разделим восприимчивость красителя χ(красителя) на действительную и мнимую части, то увидим, что его добавление смещает действительную часть показателя преломления и привносит эффект поглощения:

Теперь, подставив сюда полученную ранее лоренцовскую форму для χ(красителя), получим:

Для тартразина и красного света частота ω лежит ниже резонансной частоты ω₀, поэтому ω₀² − ω² > 0, а Δn′ положительно. Это означает, что краситель повышает показатель преломления воды. В то же время числитель выражения для κ содержит множитель γω, из-за чего эта величина становится значительной только вблизи резонанса при ω ≈ ω₀, а значит, поглощения не происходит.

Сноски

1. Ниже приведены уравнения Максвелла для электрического и магнитного полей в среде. Их я сгенерировал с помощью Claude.

Тогда возникает вопрос: «Как всё это связано с показателем преломления?»

Свободные заряды и токи отсутствуют (ρ = 0, J = 0), среда немагнитная. Закон Фарадея гласит, что ротор напряжённости электрического поля равен скорости изменения магнитного поля во времени, взятой со знаком минус. Возьмём ротор от обеих частей закона Фарадея, получив выражение:

И затем подставим в него закон Ампера — Максвелла при J = 0:

Далее подставим B = μ₀H и D = ε₀E + P = ε₀εᵣE:

Именно на этом этапе появляется εᵣ: ток поляризации ∂P/∂t суммируется с током смещения в вакууме. Тогда, считая εᵣ неизменной во времени, то есть работая на одной частоте, получаем:

Затем, уравняв обе части, мы приходим к волновому уравнению:

Для плоской волны вида E = E₀ e^(i(kz − ωt)) получается:

Сравнивая это выражение с формулой k = (n′ + iκ) ω/c для затухающей волны, которую мы записали ранее, приходим к: