Мозг является центральным органом организма человека. Да, без сердца или легких организм не выживет, но именно мозг управляет всеми системами. Еще одной важной функцией мозга является формирование и хранение памяти, куда входят не только наши воспоминания из детства, но и выученные навыки. Считается, что именно в клетках мозга хранится информация, однако эта теория может быть ошибочной (по крайней мере частично). Ученые из Нью-Йоркского университета (США) провели исследование, в котором установили, что и другие клетки, не являющиеся клетками мозга, также участвуют в процессе формирования памяти. О каких именно клетках идет речь, как они помогают мозгу в вопросах памяти, и какова практическая перспектива данного открытия? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Обучение и память у животных демонстрируют особую черту, известную как эффект массового распределения, т.е. обучения, распределенного по нескольким сессиям (распределенное обучение). Такой вариант обучения производит более сильную память, чем такое же количество обучения, примененное за один заход. Этот эффект в высокой степени сохраняется в животном мире и наблюдается как на поведенческом, так и на синаптическом уровнях. Проще говоря, зубрежка будет менее эффективна, чем изучение в несколько этапов с перерывами.

Эффект массового распределения, также известный как эффект интервала, был впервые описан Германом Эббингаузом. Он характеризуется существованием оптимального интервала между тренировочными сессиями (ITI от intertrial interval). Предыдущие исследования выявили некоторые молекулярные и клеточные компоненты, которые определяют этот оптимальный интервал. Например, исследования на Drosophila (плодовая мушка) показали, что манипулирование экспрессией SHP2 в нейронах грибовидных тел изменяет оптимальный ITI для индукции долговременной памяти (LTM от long-term memory), коррелируя с изменениями в активации внеклеточно регулируемой киназы (ERK от extracellularly regulated kinase). Аналогичным образом, исследования на Aplysia (морской заяц) продемонстрировали корреляцию между временем фосфорилирования ERK и оптимальным интервалом между тренировочными паттернами.


Изображение №1

Хотя эффект интервала обычно ассоциируется с нейронными системами, ученые предположили, что он также может наблюдаться в не-нейронных клетках, учитывая, что большая часть молекулярного инструментария для формирования памяти сохраняется во всех типах клеток (схема выше). Чтобы проверить эту гипотезу, ученые разработали не-нейронную репортерную клеточную линию для изучения эффекта интервала.

Результаты исследования

Репортерная система была создана из клеточной линии нейробластомы человека, SH-SY5Y. Выбор входных стимулов был мотивирован предыдущими исследованиями интервального обучения в нейронах Aplysia, которые использовали серотонин (5HT) в качестве стимула, индуцирующего память. 5HT задействует несколько консервативных сигнальных каскадов, и его влияние на память, как известно, зависит от протеинкиназ A и C (PKA и PKC), которые, в отличие от рецепторов 5HT, являются общими для всех эукариотических клеток. Поэтому были применены активаторы PKA и PKC к клеткам SHSY5Y вместо 5HT. Форсколин, активатор аденилатциклазы, использовался для повышения клеточных уровней циклического аденозинмонофосфата (cAMP от cyclic adenosine monophosphate) и, таким образом, активации PKA. Тетрадеканоил форболацетат (TPA от tetradecanoyl phorbol acetate) использовался в качестве прямого активатора PKC, заменяя его эндогенный вторичный мессенджер диацилглицерол. Форболовые эфиры и cAMP действительно показали свою способность заменять 5HT по крайней мере в некоторых формах синаптической фасилитации у Aplysia.


Изображение №2

Ученые отмечают, что выбор экспериментального результата также основывался на существующем понимании клеточной сигнализации в процессе формирования памяти. Хорошо известно, что индукция памяти в нейронах связана с транскрипцией немедленных ранних генов (IEG от immediate-early genes), большой сети генов раннего ответа под контролем элемента cAMP ответа (CRE от cAMP response element) и соответствующего фактора транскрипции, белка 1, связывающего элемент ответа cAMP (CREB1 от cAMP response elementbinding protein 1). Когда CREB1 фосфорилируется сигнальными киназами восходящего потока, он запускает экспрессию IEG, которые затем изменяют функцию нейрона. Хотя многие IEG относительно или полностью специфичны для нейронов (например, ферменты, продуцирующие нейротрансмиттеры, и белки синаптических везикул), CRE и CREB сохраняются во всех типах клеток и регулируют широкий спектр клеточных ответов на стимулы окружающей среды. CREB1 фосфорилируется, напрямую и косвенно, многими ключевыми сигнальными ферментами, включая PKA, PKC, ERK, p38, Akt, CaMKII и CaMKIV, которые, в свою очередь, получают свои входные данные от различных рецепторов и вторичных мессенджеров и, таким образом, кодируют клеточный опыт в реальном времени. CREB служит интегратором этой экспериментальной информации, который преобразует временные паттерны клеточной сигнализации в устойчивые клеточные изменения. Поэтому была выбрана экспрессия люциферазы, находящейся под контролем CRE, в качестве прокси для клеточной памяти. Чтобы гарантировать, что считывание представляет собой немедленную транскрипционную активность, а не накопление белкового продукта, ученые использовали короткоживущий вариант люциферазы, модифицированный дестабилизирующей PEST последовательностью (2A). Моноклональная клеточная линия была получена из клеток SH-SY5Y, стабильно трансфицированных CRE-зависимой, модифицированной PEST люциферазой, и названа CRE-luc.

Для калибровки системы ученые сначала измерили реакцию CREluc на форсколин и TPA (2B, 2C). Клетки содержались в бессывороточной среде в течение 24 часов до начала эксперимента. При t = 0 клетки перфузировались средой, содержащей любой из двух агонистов в различных концентрациях, и реакции измерялись через 4 часа после начала обработки. Препараты применялись либо в виде одного 3-минутного импульса с последующим вымыванием среды, либо непрерывно в течение 4-часовой инкубации. Оба соединения вызывали устойчивую экспрессию люциферазы при t = 4 часа. Интересно, что реакции на TPA (2C) были примерно одинаковыми независимо от продолжительности обработки, тогда как реакции на форсколин (2B) различались сильнее между одиночным 3-минутным импульсом и непрерывной 4-часовой инкубацией, демонстрируя более высокую чувствительность к продолжительности обработки.

Для последующих экспериментов были выбраны концентрации как форсколина, так и TPA, которые вызывали минимальный эффект после одного импульса каждого: форсколин использовался в концентрации 2 мкМ, а TPA 2 нМ. Это позволило получить большее динамическое соотношение индукции люциферазы в ответ на различное количество импульсов.

Чтобы максимально точно воспроизвести свои прошлые исследования, в которых 5HT действовал через сигнальные каскады PKA и PKC26–29, ученые использовали комбинацию форсколина и TPA, доставляемых одновременно (2E). Один 3-минутный импульс этой комбинации препаратов вызывал надежную экспрессию люциферазы через 4 часа после обучения. Четыре импульса того же самого (ITI = 10 минут) также вызывали экспрессию люциферазы, которая была примерно в 1.4 раза выше (n = 3). Однако через 24 часа экспрессия люциферазы, вызванная одним импульсом, снижалась, но оставалась относительно стабильной в клетках, получивших четыре импульса, что в конечном итоге приводило к 2.8-кратной разнице между условиями (n = 14). Аналогичные эффекты наблюдались как для TPA (2F), так и для форсколина (2G) по отдельности. Наибольшие различия между эффектами одиночного импульса и повторных импульсов (увеличение на 29% против 391% по сравнению с необработанными контролями через 24 часа соответственно) наблюдались для TPA. Примечательно, что продолжительность обработки TPA практически не оказывала влияния на экспрессию люциферазы (2C). Похоже, что в то время как PKA более чувствительна к продолжительности стимуляции, PKC более чувствительна к количеству событий.

Особенно примечательно, что разница в индукции люциферазы 1 против 4 импульсов TPA или TPA+форсколин становится значительно выраженной через 24 часа, хотя стимуляция во всех случаях прекращается менее чем через 1 час после начала протокола, и через 4 часа индукция люциферазы сопоставима. Этот результат хорошо согласуется с установленной динамикой формирования памяти: повторение влияет не только на непосредственную силу памяти, но и на скорость забывания, и поэтому долгосрочные различия памяти между протоколами обучения возникают с течением времени. Это явление наиболее известно выражено в кривых забывания Эббингауза, наклоны которых меняются с каждым последующим повторением обучения.

Результат также демонстрирует полезность короткоживущей конструкции репортера с меткой PEST, поскольку без дестабилизирующей последовательности было бы невозможно наблюдать клеточное забывание. Поскольку повышенные уровни люциферазы могут быть удалены из клеток через 24 часа после обучения, их сохраняющаяся экспрессия в клетках, обработанных 4 импульсами TPA, отражает не просто накопление продукта, но и продолжающуюся активность промотора CRE и, таким образом, продолжающуюся транскрипцию IEG. Примечательно, что наблюдалась продолжающаяся экспрессия люциферазы далеко за пределами краткой временной шкалы IEG генов, обычно регистрируемой в нейронных системах. Возможны несколько объяснений. Не-нейронные клетки могут содержать дополнительные механизмы для устойчивой транскрипционной индукции, или нейронные клетки могут обладать дополнительными механизмами, ограничивающими такую устойчивую транскрипцию. Транскрипция различных генов может дифференциально поддерживаться во времени, например, посредством дифференциального перехода к транскрипции, независимого от фосфорилирования CREB. Стимуляция химическими агонистами может вызывать гораздо более сильные ответы, чем эндогенная синаптическая стимуляция. Или чувствительность системы может позволить наблюдать транскрипционные изменения более надежно, чем в нейронах.


Изображение №3

На следующем этапе исследования ученые приступили к изучению эффекта массового распределения. Клетки обрабатывались либо одним 3-минутным импульсом комбинации TPA+форсколин, либо каждым препаратом по отдельности; четырьмя импульсами, с интервалом в 10, 20 или 30 минут; или одним четверным 12-минутным импульсом, представляющим состояние распределения (3A–3C). Экспрессию люциферазы измеряли через 24 часа после обработки. Во всех случаях экспрессия люциферазы, вызванная разнесенными импульсами, была значительно выше, чем при массированной обработке. Для TPA+форсколин и TPA по отдельности оптимальный ITI составлял 10 минут, а индукция люциферазы уменьшалась с увеличением времени между импульсами. Для одного форсколина разница между ITI была менее выраженной, при этом оптимальным было значение 20 минут. Это говорит о том, что PKA и PKC «настроены» на разные ITI, а это означает, что реакции на нейромодуляторы, такие как 5HT, на самом деле могут быть интерактивным суммированием этих перекрывающихся временных линий.

В своих предыдущих исследованиях Aplysia ученые наблюдали, что два события с интервалом в 45 минут оказали такое же влияние на долговременную память, как и четыре события с интервалом в 15 минут — другими словами, только два события и их временной интервал были критическими для индукции сенсибилизационной памяти в этой системе. Хотя точные механизмы этой временной специфичности остаются неизвестными, ученые проверили, реагируют ли клетки CRE-luc также на общую продолжительность протокола обучения, а не на повторение обучающих импульсов, включив в эксперименты двухимпульсные протоколы, которые соответствовали времени первого и последнего импульса в четырехимпульсных протоколах обработки TPA. Эти двухимпульсные протоколы, однако, не вызывали устойчивой экспрессии люциферазы, что указывает на то, что повторение > 2 обучающих импульсов имеет решающее значение для эффекта.

Следовательно, наблюдался классический эффект распределения, при этом также было продемонстрировано существование оптимального, ненулевого ITI для индукции максимальной памяти в клетках CRE-luc.

Чтобы дополнительно охарактеризовать эффект распределения в клетках CRE-luc, ученые изучили влияние различных протоколов обработки TPA (1×, 4× и массированный) на фосфорилирование CREB и ERK, важного узла клеточной сигнализации, который действует выше CREB и интегрирует временные события в функцию формирования долговременной памяти, включая сигналы от PKA и PKC. Клетки были лизированы сразу после окончания протокола обучения. Вестерн-блот показал устойчивое фосфорилирование ERK после всех обработок и CREB после 4× и массированной обработки (3D, 3E).

Однако оба типа фосфорилирования были значительно сильнее в клетках, обработанных 4-разнесенными импульсами по сравнению с массированной парадигмой. Поэтому наблюдался эффект массированного распределения на уровне посттрансляционных модификаций сразу после протокола обработки. Следовательно, временная дискриминация между разнесенными и массированными парадигмами происходит, по крайней мере, частично выше активации ERK. Примечательно, что когда клетки лизировались через 1, 2 или 4 часа после протокола обработки, различия в эффектах между парадигмами постепенно уменьшались, но через 24 часа снова становились очевидными: хотя остаточное повышение P-ERK было скромным (~50% по сравнению с ~600%, наблюдавшимися сразу после обучения), оно наблюдалось только в клетках, которые получили обработку 4×TPA. Это позволяет предположить, что дополнительные механизмы для дифференциального поддержания фосфорилирования ERK могут вступать в игру > 4 часов после обучения.

В состоянии покоя ERK локализуется в цитозоле. После фосфорилирования ERK перемещается в ядро, где проявляет свои основные нисходящие эффекты, такие как активация факторов транскрипции, включая CREB. Чтобы изучить, приводят ли парадигмы разнесенной и массированной обработки к дифференциальной транслокации ERK в ядро, ученые изучили локализацию общего ERK и P-ERK методом иммунофлуоресценции сразу после обработки TPA (3F–3H). Как и ожидалось из результатов вестерн-блоттинга, наблюдалась значительная индукция фосфорилирования ERK разнесенными импульсами TPA (3F–3G). Различия, наблюдаемые между условиями, были ниже, чем те, которые наблюдались при вестерн-блоттинге (3D–3E), но это сжатие эффектов объясняется значительным неспецифическим связыванием антитела P-ERK. Чтобы учесть этот эффект, ученые использовали 30-минутную обработку ингибитором фосфорилирования ERK U0126, который вызывает почти полное (~ 96%) удаление P-ERK. Плотность сигнала P-ERK, наблюдаемая с помощью иммунофлуоресценции после идентичной обработки U0126 (3G), таким образом, демонстрирует реальный базовый уровень для фосфорилирования ERK и подтверждает, что иммунофлуоресценция сильно недооценивает величину изменений P-ERK. Несмотря на это ограничение, наблюдалось значительно большее ядерно-цитозольное соотношение P-ERK сразу после интервального обучения по сравнению с массированным обучением (3H). Та же тенденция наблюдалась для общего ERK. В целом, как фосфорилирование, так и ядерная транслокация ERK по-разному реагируют на массированные и интервальные обработки TPA. Это указывает на то, что временной паттерн стимуляции декодируется, по крайней мере частично, либо самим ERK, либо выше этой киназы.

Аналогично соотношению P-ERK/общий ERK, соотношение P-CREB к общему CREB через 24 часа после обучения также значительно различалось между парадигмами обучения и было самым высоким в клетках, обработанных 4×TPA. Соотношение P-CREB/общий CREB было лишь немного выше базового уровня после обработки 4×TPA, и вместо этого оно было ниже базового уровня в клетках, которые получили субоптимальное обучение (1×TPA и массированный TPA). В то же время наблюдалось скромное увеличение общего белка CREB в клетках, обработанных 4×TPA, но не в клетках, обработанных 1×TPA или массированным TPA. Когда два эффекта (на соотношение P-CREB/общий CREB и на общий белок CREB) были умножены (учитывая, таким образом, абсолютные уровни S133 P-CREB через 24 часа после обучения), продукт в клетках, обработанных 4×TPA, был значительно выше базового уровня и значительно больше, чем в других парадигмах. Эти результаты предполагают, что CREB-зависимая транскрипция регулируется не только посредством фосфорилирования CREB, но и посредством контроля уровней общего белка CREB, и оба эффекта преимущественно индуцируются интервальным обучением, тогда как субоптимальные парадигмы обучения фактически снижают транскрипционную способность клетки путем подавления P-CREB.


Изображение №4

Для изучения роли ERK и CREB в опосредовании эффекта распределения ученые использовали U0126, ингибитор фосфорилирования ERK, и 666-15, ингибитор транскрипционной активности CREB. Клетки предварительно инкубировали с любым из ингибиторов за 10 минут до начала периода обучения. Препараты поддерживались в культуральной среде в течение всего периода обучения и вымывались либо через 1 час после окончания обучения (+1 час), либо через 24 часа после сбора образцов (+24 часа). Экспрессию люциферазы измеряли в точке времени 24 часа с помощью вестерн-блоттинга вместе с общим/фосфо-ERK и CREB, с гистоном H3, используемым в качестве контроля нагрузки (4A).

U0126 (10 мкМ) значительно снизил экспрессию люциферазы через 24 часа после обработки 4×TPA, когда ингибитор был вымыт через 1 час после обучения (4A). 24-часовая обработка U0126 фактически повысила уровни люциферазы, но она также пропорционально увеличила базовый уровень экспрессии в клетках, обработанных только U0126. Это предполагает, что дополнительные механизмы могут влиять на уровни люциферазы после такого длительного ингибирования ERK — например, повышение может быть результатом снижения протеасомной функции, что стабилизирует конструкцию с меткой PEST. Несмотря на этот эффект, наблюдалось прогрессивное снижение соотношения индукции люциферазы при 4×TPA и массовых протоколах. Это предполагает, что длительная активность ERK помогает поддерживать эффект распределения. Как и ожидалось, U0126 также сильно снизил фосфорилирование ERK и CREB через 24 часа. U0126 не повлиял на общие уровни CREB через 24 часа, хотя повышение общего CREB в ответ на 4×TPA все еще было значительным.

666-15 (1 мкМ) также значительно снизил экспрессию люциферазы через 24 часа после обработки 4×TPA, как при вымывании препарата через 1 час после обучения, так и при поддержании в течение 24 часа (4A). Оба вида обработки были достаточны для того, чтобы приблизить соотношение индукции люциферазы 4×TPA и массовыми протоколами к 1, полностью блокируя эффект распределения (4B). Интересно, что хотя 666-15 действует, предотвращая связывание CREB с CBP, а не фосфорилирование CREB, наблюдалось значительное снижение соотношения P-CREB(S133)/CREB, когда клетки инкубировали только с ингибитором, эффект, по-видимому, предотвращаемый обработкой TPA. Также было отмечено значительное снижение общих уровней CREB в ответ на 666-15, когда результаты для всех условий были усреднены и сравнены со средними уровнями CREB в отсутствие 666-15. Это говорит о том, что когда CREB не может связываться со своими мишенями, он непропорционально дефосфорилируется и, возможно, деградирует — динамика, которая может обеспечить один из механизмов клеточной памяти. Наконец, 24-часовая обработка 666-15 вызвала значительное снижение уровней P-ERK после 4×TPA, что предполагает положительную обратную связь между устойчивой транскрипцией, опосредованной CREB, и активностью ERK. Следовательно, устойчивая, взаимозависимая активность как ERK, так и CREB необходима для долгосрочной индукции CRE-luc, и в частности, путем интервального обучения.

Чтобы убедиться, что описанные выше эффекты не были вызваны нейроноподобными свойствами клеток нейробластомы, ученые проверили результаты на другой линии клеток человека, полностью извлеченной из нервной системы — клетках HEK293, полученных из эмбриональной почки. Ученые создали стабильную моноклональную клеточную линию на основе HEK293, экспрессирующую ту же конструкцию CRE-luc, которая использовалась в этом исследовании. При обработке TPA (1×, 4× и массированной) эти клетки показали значительно более сильную индукцию люциферазы через 24 часа после обработки с 4-кратным интервалом по сравнению с двумя другими парадигмами (4C). Когда клетки HEK293 были обработаны таким же образом и лизированы сразу после обработки, клетки, обработанные 4×TPA, также показали ожидаемое непропорциональное повышение соотношений P-ERK/общий ERK и P-CREB/общий CREB по сравнению с клетками после массированной обработки TPA (4D). В целом, клетки HEK293 продемонстрировали сильный эффект интервала, что еще больше обобщает полученные результаты.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые попытались понять, участвуют ли клетки, не являющиеся клетками мозга, в процессе формирования памяти. Основой этого предположения стал эффект распределения, который также присутствует и при изучении человеком новой информации: интервальное излучение с перерывами оказывается куда более эффективным, чем одноэтапное изучение (зубрежка).

В данном исследовании ученые воспроизвели обучение с течением времени, изучая два типа немозговых человеческих клеток в лаборатории (один из нервной ткани и один из почечной ткани) и подвергая их воздействию различных паттернов химических сигналов. В ответ немозговые клетки включили «ген памяти» — тот же ген, который включают клетки мозга, когда они обнаруживают паттерн в информации и реструктурируют свои связи для формирования воспоминаний. Для визуализации и контроля данного процесса ученые сконструировали клеточные образцы таким образом, чтобы они производили флуоресцентный белок, который указывал бы на активацию гена памяти.

Результаты опытов показали, что клетки могли определять, когда химические импульсы, имитирующие выбросы нейротрансмиттера в мозге, повторялись, а не просто продлевались — точно так же, как нейроны в мозге могут регистрировать, когда процесс изучения информации происходит с перерывами, а не за один присест. В частности, когда импульсы подавались через разнесенные интервалы, они активировали «ген памяти» сильнее и на более длительное время, чем когда та же самая обработка происходила одноэтапно.

Авторы исследования заявляют, что их находка не только поможет лучше понять механизмы формирования памяти, но и стать базисом для создания инструментов по борьбе с заболеваниями, которые ее нарушают. Результаты исследования также указывают на то, что память присутствует по всему организму, т. е. определенные органы, а точнее клетки этих органов, «помнят» те или иные процессы (график приема пищи, к примеру). Следовательно, необходимо учитывать эту немозговую память для поддержания здоровья организма.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?