Прионы — это чрезвычайно живучие инфекционные белки. Изучение их способностей к изменению формы может открыть уроки того, как белки складываются на молекулярном уровне, и помочь учёным разработать более совершённые белки.

Зачастую крупные открытия в области биологии происходят при изучении крошечных существ. И многое из того, что мы сегодня считаем догмой, появилось благодаря изучению конкретных микроорганизмов.

Эксперименты с бактерией Streptococcus pneumoniae не только привели к открытию ДНК как основной наследственной молекулы, но и позволили создать первые инструменты для генной инженерии. Изучение РНК опухолевых вирусов позволило обнаружить обратную транскриптазу — фермент, необходимый для изучения биологии РНК. Эти модельные микроорганизмы долгое время служили природными лабораториями, позволяя расшифровывать фундаментальные принципы жизни и предоставляя инструменты, необходимые для их изучения.

Перейдя от микроорганизмов к макромолекулам, биология вступила в эру белков. Последние достижения в области искусственного интеллекта, включая такие инструменты, как нобелевский лауреат AlphaFold, сделали возможным предсказание структуры белков, превратив кропотливый лабораторный процесс в вычислительную задачу, которую можно решить за считанные минуты.

Вооружившись новыми знаниями, биологи надеются разработать ферменты, которые смогут катализировать совершенно новые реакции, например, превращать пластик в полезное топливо или создавать новые лекарства с помощью специальных катализаторов. Однако, несмотря на стремительный прогресс в области биологии белка, «основные» характеристики этих молекулярных машин — как они складываются, как меняют форму и как простые последовательности аминокислот могут создавать формы невероятной сложности — остаются неизвестными.

Исторически сложилось так, что биологи изучали структуру белков с помощью кристаллографии и электронной микроскопии — методов, позволяющих получать статичные снимки молекул, застывших во времени. Хотя такой подход позволил многое понять, эти инструменты слишком медленные для того, чтобы можно было уловить динамику белков. Однако есть и другой подход, который может помочь: систематическое изучение специализированных белков, таких как прионы, — белков с уникальными изменяемыми конформациями, которые управляют инфекционным и другим поведением. Если мы научимся использовать прионы в качестве природной лаборатории для моделирования динамики белков, это может приблизить нас к освоению дизайна белков в целом.

Заразительная идея

Большинство людей имеют хотя бы зачаточное представление о том, как действуют вирусы и бактерии, но прионы остаются загадочными. Даже самое печально известное их проявление, коровье бешенство, кажется скорее поучительной историей о заражённой говядине, чем окном в один из самых захватывающих механизмов биологии.

Прионы — это белки, которые могут существовать как минимум в двух различных формах, или конформациях. В своей нормальной форме они выполняют полезные функции в клетке, например, сигнализируют. Однако в аномальной форме они приобретают способность переводить другие копии того же белка из нормального состояния в неправильное — процесс, известный как матричное преобразование. Это преобразование происходит при непосредственном контакте между белками.

Когда неправильно свёрнутый [misfolded] прионный белок (часто обозначаемый как PrPSc) встречается со своим нормально свёрнутым аналогом (PrPC), он действует как шаблон, заставляя нормальный белок изменить свою форму. Каждый из них может затем преобразовать другие, создавая экспоненциальный каскад, похожий на молекулярный эффект домино. Это происходит потому, что неправильное сворачивание обнажает скрытые, липкие участки белка, заставляя их слипаться в более крупные структуры, называемые амилоидными фибриллами. Эти фибриллы нарушают нормальную работу клеток, приводя к необратимым болезненным состояниям. Важно, что для этого процесса не требуется ни ДНК, ни РНК; белки сами влияют на другие белки, изменяя их форму.

Когда-то учёные считали такое поведение невозможным. Однако в 1982 году, после десяти лет исследований, Стэнли Прусинер и его команда учёных из Сан-Франциско сделали революционное открытие, изучая овец, заражённых скрепи, смертельным неврологическим заболеванием. Из тканей мозга больных они выделили инфекционный агент, не похожий ни на что известное ранее. В нём не было ни ДНК, ни РНК, ни вирусов — только один белок. Прусинер назвал этот белок «прионом», сокращение от «белковая инфекционная частица» [proteinaceous infectious particle]. Его работа, продемонстрировавшая, что белки могут распространять болезни сами по себе, разрушила фундаментальные представления о передаче заболеваний.

Работа Прусинера с прионами поначалу была встречена со скептицизмом и даже насмешками со стороны видных учёных, включая нобелевского лауреата Дэвида Балтимора. Представленная его группой статья в журнале Science несколько месяцев находилась в подвешенном состоянии из-за страха перед последствиями его результатов.

«Трудно передать тот уровень враждебности, который вызывало слово „прион“ и сама концепция приона», — писал позднее Прузинер о своём открытии. В конце концов, как может белок реплицироваться без ДНК или РНК? Но, как и другие идеи, менявшие парадигму до него, его «ересь» оказалась революционной. Проведя серию тщательных экспериментов в 1980-х и 1990-х годах, Прусинер описал механизм, лежащий в основе разрушительного каскада прионов. Хотя эта работа позволила установить, что прионы являются возбудителями таких разрушительных заболеваний, как болезнь Крейтцфельдта-Якоба и куру, оставались важные вопросы о том, могут ли эти самовоспроизводящиеся белки быть чем-то большим, чем возбудителями болезней.

Другие исследователи, например Сьюзан Линдквист из Массачусетского технологического института, развили открытие Прусинера, изучив прионы в новых контекстах. На протяжении большей части своей карьеры Линдквист занималась прионами дрожжей и закономерностями их наследования. В 1994 году она показала, что самораспространяющиеся белковые структуры — прионы Прусинера — могут служить эпигенетическими элементами, передавая информацию между поколениями без изменения последовательности ДНК. Проводя прямые параллели между нейродегенеративными заболеваниями и необычными схемами наследования, которые она наблюдала у дрожжей, Линдквист сказала: «Все они испытывают последствия неправильного фолдинга белков».

Знаменательное открытие Ридом Викнером полезных прионов в дрожжах вывело их область деятельности за пределы патологии, и породило предположение, что прионоподобное поведение может быть фундаментальным механизмом наследования на основе белков, когда фермент становится активным только после того, как его неактивный предшественник переходит в активное состояние.

Совсем недавно исследователи из Колумбийского университета раскрыли ещё более интригующую роль прионоподобных белков: оказывается, они кодируют долговременную память. Такие белки, как CPEB у морских слизней, которые обычно связываются с РНК и регулируют синтез белка, и CPEB3 у млекопитающих переходят из растворимой формы в агрегатное состояние, запуская синтез белка, необходимый для поддержания воспоминаний. Это открытие позволяет предположить, что прионы могут быть не просто механизмом передачи болезни, а фундаментальным способом поддержания в клетках устойчивых изменений.

Особый интерес представляет то, как чрезвычайная стабильность прионов противоречит общепринятым представлениям о сворачивании белков. Большинство функциональных белков существуют в хрупком равновесии между неподвижностью и гибкостью — достаточно прочные, чтобы сохранять свою форму, но достаточно гибкие, чтобы выполнять свою работу. Прионы делают и то, и другое: они претерпевают большие конформационные изменения, требующие значительной молекулярной мутабельности, но после преобразования образуют прочные агрегаты, которые противостоят почти всем попыткам денатурации.

В то время как простые стерилизационные растворы, такие как этанол или отбеливатель, легко уничтожают бактерии и вирусы, неподвижные агрегаты прионов в их неправильном состоянии крайне сложно разрушить. Ни один из обычно надёжных лабораторных механизмов уничтожения и денатурации, включая автоклавирование при температуре до 600°C, ультрафиолетовый свет, отбеливатель, этанол и мягкую кислоту, не может эффективно нейтрализовать заражённые прионами поверхности и вывести их из инфекционного состояния.

Считается, что такая стабильность связана с так называемой «перекрёстной β-структурой» — особым способом, с помощью которого белки складываются в чрезвычайно стабильные листы. Этот же структурный мотив проявляется при таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, где белки также образуют неизменные агрегаты, называемые амилоидными фибриллами.

Способность прионов переходить из гибкого в почти кристаллическое состояние делает их уникальными для изучения обеих крайних точек спектра стабильности белков, помогая нам разрабатывать лучшие терапевтические антитела, которые остаются стабильными во время хранения, но достаточно гибкими, чтобы связываться, или создавать молекулярные переключатели, которые меняют состояние по требованию. Понимание их устойчивости также может стать ключом к созданию белков, способных работать в более экстремальных условиях, таких как дно океана или промышленные реакторы, функционирующие в глубоком космосе.

Что ещё более важно, прионы с их чётко определёнными переходами между состояниями могут стать идеальными тренировочными данными для обучения искусственного интеллекта прогнозированию динамики белков.

Структурная революция

На протяжении большей части истории современной биологии разгадка структуры белка требовала кропотливых усилий. Рентгеновская кристаллография стала основным инструментом для определения структуры с тех пор, как Макс Перутц и Джон Кендрю впервые раскрыли структуру гемоглобина в 1960 году. В процессе исследования белки облучаются рентгеновскими лучами, а по полученным дифракционным картинам восстанавливается их трёхмерная структура. Однако для этого необходимо заставить белки превратиться в кристаллы — процесс, который может занять годы кропотливой оптимизации, если вообще сработает.

В качестве примера одного из самых экстремальных проявлений привередливости рентгеновской кристаллографии можно привести заявление одного недовольного кристаллографа – он отметил, что «сок из маринованных огурцов марки Sweet & Snappy Classic оказался единственным вариантом, с которым успешно кристаллизовался наш мутантный белок». Этот анекдот подчёркивает, насколько кристаллография белков остаётся скорее импровизацией, чем наукой, а успех часто зависит от готовности попробовать необычные экспериментальные методы.

Возможность разбираться в структуре белка улучшилась с развитием криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) в 1980-х годах. В крио-ЭМ белки замораживаются в нативном состоянии, после чего их изображения получают с помощью электронного микроскопа с разрешением, достаточным для того, чтобы зафиксировать крупные белковые комплексы и мембранные белки. Результаты обоих методов попадают в растущий открытый научный репозиторий данных под названием Банк данных о белках (PDB). PDB начал работу в 1971 году с семи структур, и сегодня представляет собой цифровой архив, в котором хранятся точные трёхмерные координаты каждого атома в структуре белка, а также экспериментальные данные о том, как эти координаты были определены.

Но даже с постоянным развитием лабораторных инструментов, таких как крио-ЭМ и данные из PDB, определение структуры одного белка по-прежнему занимало месяцы или годы работы. К 2020 году, после более чем полувековых усилий, учёные разгадали лишь около 170 000 белковых структур — ничтожную долю из миллионов известных.

Всё изменилось в 2021 году, когда Джон Джампер и Демис Хассабис, команда Google DeepMind, представили AlphaFold2. Обученная на данных из PDB, эта система могла предсказывать высокоточные структуры белков за считанные минуты. В конкурсе Critical Assessment of Structure Prediction (CASP), где методы оцениваются по их способности предсказывать атомные координаты недавно решённых структур, AlphaFold2 достигла уровня точности, сравнимого с экспериментальными методами, для большинства белков, которые она видела. Это был беспрецедентный скачок, который заставил основателя конкурса Джона Моулта заявить, что проблема предсказания структуры белков «в некотором смысле решена».

Уже через два года после выпуска AlphaFold с её помощью были предсказаны структуры протеома человека, а также многих других биологически значимых белков — всего более 200 миллионов структур. Вычислительный биохимик и нобелевский лауреат 2024 года Дэвид Бейкер и его команда из Вашингтонского университета вскоре представили RoseTTAFold, аналогичную модель предсказания структур. Структурная биология быстро превратилась из узкопрофильной экспериментальной науки в науку, где любой исследователь мог легко получить доступ к вероятной форме практически любого белка.

Состояния считаются «вероятными», потому что у этих инструментов искусственного интеллекта есть значительные «слепые пятна». Хотя AlphaFold и подобные инструменты отлично справляются с предсказанием наиболее стабильной формы белка, они не могут предсказать, как белки «вихляют» и «колеблются» между несколькими структурами. Внутри живых клеток белки ведут себя скорее как жидкости, чем как твёрдые тела, скручиваясь и меняя форму в процессе выполнения своих функций. Ферменты, например, резко меняют форму, чтобы ухватиться за молекулы-мишени. Молекулярные машины, такие как кинезин, движутся по клеточным путям, переходя в разные конформации. Сигнальные белки переключаются между активным и неактивным состоянием. Эти динамические процессы — самая суть того, как белки работают на самом деле, — остаются практически невидимыми для современных инструментов прогнозирования.

Проблема заключается в том, как обучались эти системы искусственного интеллекта. Для каждой белковой структуры в PDB AlphaFold2 показывают соответствующую белковую последовательность (а также эволюционно родственные белковые последовательности) и ставят задачу предсказать 3D-координаты каждого атома. В ходе этого процесса модель учится предсказывать наиболее вероятную структуру для данного белка, обычно представляющую собой одну термодинамически благоприятную конформацию. Хотя эта парадигма обучения позволила создать невероятно мощные модели, её неспособность предсказывать что-либо, кроме этих наиболее вероятных структур, делает функциональное разнообразие изучаемого мира белков несколько плоским.

Ограничения этой парадигмы обучения особенно очевидны при попытке предсказать структуры белков, которые меняют форму в рамках своей функции — свойство, которое, по-видимому, встречается гораздо чаще, чем можно предположить по отдельным состояниям, полученным с помощью AlphaFold или крио-ЭМ.

Возьмём АТФ-синтазу, молекулярный двигатель, создающий молекулы топлива для клетки. Из прямых наблюдений мы знаем, что она функционирует как наноразмерный роторный двигатель, центральный вал которого вращается, преобразуя энергию потока протонов в производство АТФ. Хотя модели искусственного интеллекта могут предсказать форму отдельных компонентов АТФ-синтазы с впечатляющей точностью, они не могут передать динамику вращательного движения, потому что данные, подаваемые в эти модели, показывают только наиболее легко кристаллизуемые конформации белков. Тот же недостаток относится и к мембранным белкам, которые должны сгибаться и разгибаться, чтобы переносить молекулы через клеточные мембраны.

Хотя усилия по созданию моделей, способных предсказывать гибкость и конформационные изменения белков, предпринимаются, прогресс идёт медленно. Попытки адаптировать AlphaFold2 для предсказания конформеров с несколькими состояниями увенчались лишь ограниченным успехом.

Это говорит о том, что исследователи стоят на важнейшем перепутье в структурной биологии, нуждаясь не только в более совершённых вычислительных инструментах, но и в совершенно новых модельных системах для изучения динамики белков.

Прионы и динамика белков

Прионы предлагают путь развития. Их способность переключаться между различными стабильными состояниями — от растворимых мономеров до агрегированных полимеров — представляет собой один из примеров резкого конформационного изменения белка, который можно экстраполировать на понимание того, как белки сворачиваются и взаимодействуют в более широком смысле.

Прионный переход позволяет сделать обобщающие выводы; он демонстрирует, как локальные взаимодействия между белковыми доменами могут вызывать глобальные конформационные изменения, и показывает, как относительно небольшие изменения в аминокислотных контактах могут приводить к кардинально иным стабильным состояниям с изменёнными биохимическими свойствами. Эти изменения можно наблюдать в таких модельных организмах, как дрожжи.

Помимо динамики белков, прионы также раскрывают механизмы, с помощью которых конформационные изменения в правильно закодированных белках могут приводить к дисфункции без генетических мутаций. Это, в свою очередь, помогает выявить взаимосвязь между кодом гена и белком, который он в итоге создаёт.

Последние достижения в области крио-ЭМ позволили получить снимки высокого разрешения структур прионных белков в их нормальном и неправильном состоянии, а также промежуточных форм в процессе превращения. Замораживая прионы на разных этапах их трансформации, учёные могут создать молекулярную хронологию, показывающую, как эти белки переходят из одного состояния в другое.

Несмотря на эти многообещающие возможности, прионы по-прежнему мало используются в более широком изучении динамики белков, отчасти из-за соображений безопасности. Ведь они смертельно опасны. Патогенные прионы вызывают смертельные нейродегенеративные заболевания со 100% смертностью, и, в отличие от бактерий или вирусов, их нельзя нейтрализовать с помощью стандартных методов стерилизации.

К счастью, открытие полезных прионов в дрожжах предлагает более безопасный путь. Эти белки демонстрируют такое же конформационное переключение и самораспространение, как и их опасные человеческие аналоги, но в безвредном организме, которым легко манипулировать. Помимо доброкачественных дрожжевых моделей, современные протоколы биобезопасности и специализированные изоляторы третьего уровня позволяют безопасно изучать патогенные прионы, а вычислительное моделирование и системы in vitro предлагают дополнительные пути к пониманию поведения прионов без риска облучения.

Если модели искусственного интеллекта научатся предсказывать, как и когда прионы меняют форму и влияют на другие белки, чтобы они делали то же самое, то мы ещё немного приблизимся к высокой цели — решению задачи сворачивания белков. Учитывая недавние данные о том, что многие белки в PDB существуют в нескольких стабильных формах, а не только в одной фиксированной, это кажется особенно актуальным. Согласно этой точке зрения, прионы — это не аутсайдеры, а скорее яркие примеры того, что многие белки делают не так явно.

Изучение изменения формы прионов может также раскрыть более фундаментальную особенность природных ферментных механизмов. Ферменты — это, по определению, функциональные белки, которые навязывают свою «волю» через изменения в структуре. Отсюда следует, что изучение прионов может указать на принципы, применимые к конструированию других функциональных и полезных белков, создаваемых на заказ для решения любых задач.

Подобно тому, как использование E. coli выходит за рамки изучения оперона lac и превращается в полезный инструмент для биологического применения путём трансформации, прионы могут служить не только моделью динамики белков. Например, исследования функционализированных амилоидов, вдохновлённых прионами, показали перспективность применения в биосенсорах, где контролируемые свойства агрегации этих белков позволяют использовать новые механизмы обнаружения. Аналогичным образом, изучение взаимодействия прионных белков с лигандами показало, как малые молекулы могут стабилизировать определённые конформационные состояния, что может стать основой для более широких стратегий контроля формы белков. И, опять же, прионы могут раскрыть механизмы неврологической деградации.

Исследование прионов даже способно открыть нечто более неизвестное. Изучение бактерий позволило обнаружить трансформацию (метод введения ДНК в живые клетки) и ДНК-полимеразу. Изучение вирусов позволило обнаружить обратную транскриптазу, полученную случайно в ходе других открытий. Изучение грибков привело к появлению новых антибиотиков — возможно, самого главного метода спасения жизней в XX веке. История показывает, что изучение отдельных биологических явлений часто приводит к непреднамеренному открытию инструментов, которые преобразуют нашу способность манипулировать живыми системами. Изучение прионов может позволить осуществить мечту синтетической биологии — создать белок для любой цели.

Последствия такого достижения выйдут далеко за рамки академического интереса. Проблема создания стабильных белковых терапевтических препаратов для лечения таких неврологических заболеваний, как болезнь Альцгеймера, при которой существующие антитела с трудом преодолевают гематоэнцефалический барьер и сохраняют структуру достаточно долго, чтобы быть эффективными, может быть решена благодаря открытию принципов конструирования белков, взятых непосредственно из прионов. Даже такие промышленные задачи, как создание ферментов, способных расщеплять пластиковые отходы или улавливать углекислый газ более эффективно, чем природные белки, будут зависеть от нашей способности понимать, предсказывать и в конечном итоге диктовать динамику белков.

Ещё в 1999 году Сьюзан Линдквист заявила: «[белковые] исследования на дрожжах дают возможность значительно увеличить скорость, с которой мы можем исследовать фундаментальную природу процессов человеческих заболеваний, а также разрабатывать и тестировать новые терапевтические стратегии. Фундаментальные принципы биохимии и клеточной биологии объединяют разнообразные формы жизни на Земле». Прошедшие двадцать шесть лет, в течение которых мы всё глубже понимали работу прионов, все больше приближают нас к такому будущему.