Даже самые грандиозные вещи куда проще понять, если разложить их на составляющие. Подобный принцип не является чем-то новым в научном сообществе, так как многие процессы и явления описывались и описываются путем предварительного обозначения их элементов. Говоря об организме человека и о заболеваниях, которыми он страдает, также крайне важно найти первоисточник недуга. Даже самые серьезные заболевания с самыми ярко выраженными симптомами берут свое начало из строительных блоков любого живого организма — клеток. Создание механизма непосредственного воздействия на клетки с последующим их восстановлением является одной из важнейших задач современной науки. Ученые из университета штата Пенсильвания (США) стали на шаг ближе к достижению этой цели, разработав белковый нанокомпьютер, способный модулировать поведение клеток. Из чего сделан компьютер, какими именно функциями он обладает, и как именно он может быть использован на практике? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Клетки обнаруживают биохимические, структурные и механические сигналы окружающей среды и используют эту информацию для принятия решений, координации задач и изменения своего поведения. В основе этих процессов лежат сложные вычислительные операции, проводимые белковыми сетями, которые получают входные сигналы, обрабатывают информацию и производят функциональные выходные данные.

Понимание этого процесса позволит ученым из области синтетической биологии научиться перепрограммировать клеточное поведение. Искусственные клетки со встроенными инструкциями, созданные с использованием ДНК или белков, могут открыть путь для реализации биосенсорного анализа и биоремедиации в науках об окружающей среде, для диагностики заболеваний и инновационных терапевтических применений в медицине.

Говоря о вычислительном процессе, стоит отметить, что фундаментальным его элементом является логический вентиль. Недавние достижения в области синтетической биологии включают попытки создания генетических цепей, которые функционируют как различные логические элементы, в которых функциональный результат контролируется экспрессией генов целевого белка (или белков).

Экспрессия белка регулируется путем захвата процесса транскрипции ДНК или трансляции мРНК и нацеливания на основные элементы во время этого процесса, такие как факторы транскрипции, промоторы и терминаторы или мРНК. В качестве альтернативы, в некоторых исследованиях изучалась конструкция логических вентилей в белках на посттрансляционном уровне. Эти логические вентили на основе белков создаются либо путем модулирования взаимодействий белок-белок, либо путем контроля реакций, опосредованных протеазами.

Авторы рассматриваемого нами сегодня труда предложили новый метод интеграции восприятия, обработки и генерации выходных данных в едином белке, который они назвали «нанокомпьютерным агентом». Этот агент, по мнению ученых, может стать новым важным шагом в области биокомпьютинга.

Вместо того чтобы перепрограммировать генетические схемы, взаимодействия белок-белок или схемы, основанные на протеолизе, ученые попытались перепрограммировать трехмерную структуру и динамику одного белка-мишени. По сравнению с традиционными методами этот подход имеет ряд преимуществ.

Во-первых, входной сигнал немедленно изменяет конформацию белка и изменяет его функцию, минуя процессы транскрипции и трансляции. Это обеспечивает быстрое время отклика и повышенную надежность.

Во-вторых, вместо того чтобы работы с факторами транскрипции и промоторами, небольшие сенсорные домены (~ 15 кДа) вставляются в целевой белок для обеспечения функционального контроля. Таким образом, «кодирующий сценарий» заметно сжимается, а метаболическая нагрузка снижается.

В-третьих, в традиционных подходах после экспрессии или активации целевого белка функция вывода продолжается до тех пор, пока белок не расщепится (например, в результате нормальных или регулируемых процессов). Однако в новом подходе выходной функцией можно управлять с помощью светочувствительных датчиков с высокой обратимостью и пространственно-временным разрешением.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые описывают процесс создания и тестирования некоммутативной комбинаторной логической схемы в одном гибридном белке. Достигнуто это было путем включения модуля uniRapR, чувствительного к рапамицину, и модуля напряжения кислорода, реагирующего на синий свет (LOV2), в киназу Src — нерецепторную тирозинкиназу, которая играет важную роль в различных клеточных процессах (клеточная адгезия, подвижность, пролиферация, дифференцировка и т.д.).

Результаты исследования

В аллостерии* возмущение, вносимое в дистальный (аллостерический) сайт, энергетически связано с функциональным сайтом, тем самым влияя на активность белка.

Аллостерия* — это прямое и эффективное средство регуляции функции биологических макромолекул, возникающее в результате связывания лиганда с аллостерическим сайтом, топографически отличным от ортостерического сайта.

Используя белковую аллостерию, сенсорные модули были вставлены в аллостерические сайты, чтобы регулировать функции белка-мишени. В труде «Two-input protein logic gate for computationin living cells» ученые добились «логики OR (ИЛИ) с двумя входами» путем вставки uniRapR в домены киназы и LOV2 в домены киназы фокальной адгезии.

Вместо нацеливания на два разных домена белка ученые предложили включить оба сенсора в один и тот же домен белка-мишени и «запутать» аллостерические коммуникации внутри одного и того же белка-хозяина, чтобы сенсорные домены конкурировали друг с другом. Ученые считают, что такая конструкция будет устанавливать более сложные логические вычисления в одном белке, которые ранее не выполнялись.

Для проверки этой гипотезы сенсоры uniRapR и LOV2 были введены в киназный домен белка Src (изображение ниже).


Изображение №1

Сконструированное белковое устройство использовало в качестве входных сигналов рапамицин и синий свет, каждый из которых влияет на конформационную динамику Src. Результирующее конформационное изменение белка затем влияло на его сеть белкового взаимодействия внутри клетки, вызывая отчетливую функциональную реакцию.

В исследовании «Rational design of a ligand-controlled proteinconformational switch» ученые разработали молекулярный переключатель, контролируемый рапамицином (Src-uniRapR), вставив uniRapR в сайт, аллостерически связанный с активным сайтом киназного домена Src. Используя этот труд в качестве отправной точки, ученые хотели добавить датчик LOV2 для создания системы с двойным управлением, в которой активность Src могла бы регулироваться как рапамицином, так и синим светом.

Чтобы добиться функционального контроля системы с помощью синего света, необходимо было идентифицировать второй аллостерический сайт для вставки LOV2, который удовлетворял бы двум требованиям. Во-первых, вставка LOV2 должна сохранить большинство функций Src в клеточной системе. Во-вторых, сайт встраивания должен быть аллостерически связан с ключевым сайтом внутримолекулярного взаимодействия, который имеет решающее значение для поддержания аутоингибирующей конформации Src.

В трехмерной структуре Src было обнаружено в общей сложности пять открытых на поверхности петель* в дополнение к одной, используемой для вставки uniRapR.

Петля* — гибкая область вторичной структуры белка.

Воздействие петель на поверхность было подтверждено путем расчета нормализованной площади поверхности, доступной для растворителя (SASA от solvent-accessible surface area). Все пять петель были экспонированы на поверхности, и, по крайней мере, один остаток в каждой петле имеет нормализованную SASA более 40% (2A).


Изображение №2

Чтобы предсказать, играют ли эти петли функциональные роли, была выполнена оценка эволюционной консервативности каждого остатка (аминокислота в пептидной цепи) на основе нормализованных показателей консервации, рассчитанных с помощью ConSurf. Большинство остатков в этих пяти петлях не являлись консервативными и, таким образом, подходят для вставки LOV2.

Затем ученые определили, какая из пяти петель может быть модифицирована для обеспечения аллостерического контроля конформационных изменений Src, что влияет на функцию.

В физиологических условиях киназа Src принимает автоингибирующую конформацию за счет внутримолекулярного взаимодействия между доменом SH2, фосфорилированным тирозином (pTyr⁵²⁷) на С-концевом хвосте и доменом SH3 с полипролиновым линкером SH2-SH1. Ранее было установлено, что эта неактивная конформация также была стабилизирована сэндвич-подобным гидрофобным взаимодействием между Trp²⁶⁰, спиралью αC и цепью β4. Опыты показали, что делеция С-концевого хвоста незначительно активировала Src, в то время как мутация гидрофобного стека запускала сильную активацию белка.

Следовательно, ученые предположили, что LOV2, встроенный в петли, которые аллостерически связаны с этими двумя ключевыми взаимодействиями, может быть способен включать/выключать функции белка. Изучая структуру Src, было обнаружено, что петля 4 близка к С-концевому взаимодействию, а петля 5 расположена рядом с цепью β4 и, таким образом, может оказывать более сильное аллостерическое влияние, чем другие петли. Был проведен анализ аллостерических коммуникационных путей, начинающихся от каждой петли до pTyr⁵²⁷ или Trp²⁶⁰, используя Ohm. Анализ показал, что петля 5 и петля 4 имеют самый сильный аллостерический контроль над гидрофобным стеком и С-концевым взаимодействием соответственно. На основании этих результатов петля 4 и петля 5 были выбраны для вставки LOV2.

Затем было выполнено моделирование дискретной молекулярной динамики (DMD от discrete molecular dynamics) для оценки того, как вставка LOV2 в петлю 4 или петлю 5 влияет на аллостерический контроль конформационных состояний Src.

Киназа Src претерпевает конформационное изменение из неактивного состояния в активное с диссоциацией SH2-SH3 и киназного домена. Было количественно оценено расстояние между центрами масс этих двух областей, чтобы определить конформационные изменения во время моделирования. Большое расстояние указывает на диссоциацию между доменами SH2-SH3 и киназы, что указывает на активацию белка, тогда как более близкое расстояние указывает на неактивное состояние.

Когда LOV2 вставлен в петлю 5, расстояние между темным мутантом Src-LOV2 (LOV2 C450A) значительно увеличивается по сравнению с соответствующим освещенным мутантом (LOV2 I510E/I539E) (2B, 2C). Это подразумевает, что синий свет может ингибировать активацию Src в этой конструкции. Для вставки LOV2 в петле 4, однако, освещенный мутант имеет большие расстояния, чем темный мутант. Это позволяет предположить, что синий свет может активировать Src в этой конструкции.

Разница между темными и освещенными мутантами со вставкой петли 5 намного больше, чем у мутантов с петлей 4. Это указывает на то, что петля 5 обеспечивает более сильный аллостерический контроль.


Изображение №3

Далее ученые создали химико- и оптогенетически сконструированные системы путем вставки домена LOV2 в петлю 4 и петлю 5, соответственно, с использованием конструкции Src-uniRapR. Проводилось тестирование различных линкеров соединения, включая Gly-Pro-Gly (GPG), Gly-Ser-Gly (GSG) и отсутствие линкера, при присоединении LOV2 для оптимизации аллостерической регуляции. К С-концу сконструированного белка Src была прикреплена метка mCherry, чтобы визуализировать локализацию белка в клетках. Для изучения функций белков, регулируемых сенсорами, были сконструированы мутанты Src-uniRapR-LOV2-mCherry dark (темный; LOV2 C450A) и lit (освещенный; LOV2 I510E/I539E), которые временно экспрессировались в клетках MDA-MB-231. Для вставки LOV2 в петле 4 не наблюдалось какой-либо заметной разницы в клеточном фенотипе между темными и освещенными мутантами или до и после добавления рапамицина. Внешнее нарушение, вносимое LOV2 для нарушения С-концевого взаимодействия, может оказаться неспособным полностью активировать белок Src, или линкеры соединения могут быть не оптимальными для аллостерического контроля. Однако была замечена транслокация белка из цитоплазмы в фокальные адгезии после добавления рапамицина, когда LOV2 был встроен в петлю 5 с линкером GSG. Потому ученые решили использовать именно эту систему, названную Src-uniRapR-LOV2-mCherry, для дальнейшего изучения.

Ученые исследовали фенотип фиксированных клеток MDA-MB-231 со сверхэкспрессией мутанта Src-uniRapR-LOV2-mCherry dark или lit, обработанных рапамицином или без него. Добавление рапамицина значительно увеличивало количество и размер фокальных спаек как у темных, так и у освещенных мутантов (3A и 3B) по сравнению с теми, у которых не было рапамицина. В отсутствие рапамицина достоверных различий между темными и освещенными мутантами не наблюдалось.

Эти данные указывают на то, что рапамицин активирует Src, что приводит к транслокации белка и формированию фокальной адгезии. В присутствии рапамицина мутант lit имеет уменьшенное количество и площадь фокальных спаек по сравнению с мутантом dark. Эти наблюдения говорят о том, что синий свет инактивирует Src и ингибирует формирование фокальной адгезии, что противоречит аллостерическим эффектам, индуцированным рапамицином. Визуализация MDA-MB-231 в живых клетках на сетках, покрытых коллагеном, дополнительно подтверждает, что рапамицин стимулирует локализацию Src в фокальных адгезиях на периферии клеток (3C и видео №1).

Видео №1

Рапамицин регулирует активность киназы Src в конструкции Src-uniRapR. Чтобы проверить, повлияла ли активность киназы в системе с двойным контролем, был измерен уровень фосфорилирования Src Tyr⁴¹⁶ in vivo во всех возможных условиях, включая освещение, темноту, рапамицин и отсутствие рапамицина.

Активность киназы оставалась неактивной при всех условиях. Это означает, что активация и инактивация uniRapR и LOV2 вообще не влияли на активность киназы. Другая возможность заключается в том, что вставка LOV2 искажает сайт связывания аденозин-5'-трифосфата и, следовательно, устраняет активность киназы. Из-за отсутствия киназной активности наблюдалась транслокация Src в фокальные адгезии, т.е. фенотип, отличный от поляризованного распространения, когда была индуцирована киназная активность. Индуцированная киназная активность Src способствует фосфорилированию его субстратов при фокальных адгезиях и стимулирует обмен фокальных адгезий и подвижность клеток. Следовательно, при устранении киназной активности в системе оборот фокальной адгезии ингибируется. Таким образом сохраняется фокальная адгезия. И наоборот, активность активированной киназы способствует обороту фокальной адгезии и приводит к другому клеточному фенотипу.

Фокальная адгезия является основным структурным элементом клетки, соединяющим внеклеточный матрикс с актомиозиновым цитоскелетом. Он функционирует как датчик механического напряжения и геометрии, позволяя обнаруживать различные морфологические, физические и биохимические среды и использует эту информацию для координации сложного клеточного поведения. Одним из важных явлений, связанных с фокальной адгезией, является направленная миграция клеток, индуцируемая контактными сигналами внеклеточного матрикса, что необходимо для морфогенеза ткани, диссеминации раковых клеток и миграции иммунных клеток. Фокальные адгезии играют жизненно важную роль в этих процессах, так как их созревание вызывает выравнивание F-актина, что дополнительно стимулирует ориентацию клеток и направленную миграцию. Поскольку наблюдалось созревание фокальной адгезии в разработанной системе с двойным контролем, ученые хотели знать, могут ли они контролировать направление клеток на выровненных коллагеновых волокнах, служащих в качестве сигналов направления контакта.

Клетки MDA-MB-231 могут взаимно преобразовываться между веретеновидной и округлой морфологией с ламеллиподием на переднем крае. При посеве на полиакриламидные волокна коллагена nanolane, в ответ на сигналы окружающей среды, клетки MDAMB-231 принимают стержнеобразную форму с постоянным миграционным наклоном ~30°. Угловая ориентация возникает из-за наложения сил с различными осями приложения, которые создаются динамической конкуренцией между зарождающимися адгезиями и созревающими фокальными адгезиями, представленными нанополосами коллагена I типа.

В этой системе большинство формирующихся дискретных зарождающихся спаек преимущественно устанавливаются ламеллоподиальным расширением поперек наноструктуры, перпендикулярно расположенным нанополосам. Альтернативно, созревающие фокальные адгезии непрерывно распространяются вдоль нанополос, направляя расширение клеток соосно направлению нанополос, формируя динамический, механобиологически регулируемый баланс между растяжением клеток вдоль и поперек коллагеновых нанополос. Добавление рапамицина замедляло клеточную динамику, и клетки начинали удлиняться и выравниваться вдоль коллагеновых волокон как у темных, так и у светлых мутантов. В результате ориентация клеток на нанополосах коллагена была значительно снижена, в среднем менее чем на 10°. Уменьшение наклона клеток связано с увеличением количества и площади фокальных спаек по мере их созревания. Более зрелые фокальные адгезии увеличивают силы вдоль нанополос коллагена и, следовательно, сдвигают ориентацию клеток в направлении удлинения фокальных адгезий.


Изображение №4

Чтобы продемонстрировать точное управление разработанной системой и прояснить основные логические вычисления, ученые использовали конструкцию Src-uniRapRLOV2-mCherry (дикого типа) в клетках MDA-MB-231 и выполнили визуализацию живых клеток на коллагеновых нанополосах.

Добавление рапамицина сразу ингибировало динамику миграции клеток (видео ниже). Клетки начали удлиняться и смещать свое направление в сторону вертикальных нанополос. Угол популяции уменьшился в среднем с 30° до менее 10° (4B). Чтобы уточнить изменение динамики клеток, была проведена количественная оценка прироста и потери апексов в течение 2 часов. Добавление рапамицина значительно уменьшало прирост и потерю апексов, что свидетельствует о снижении клеточной динамики.

Видео №2

При включении синего света в присутствии рапамицина через 3 часа, клетки восстановили свою динамику, так как прирост и потеря апексов значительно увеличились до уровня, который достоверно не отличался от уровня до добавления рапамицина (4C). Угол ориентации клеток также увеличивался под воздействием освещения.

Чтобы понять лежащие в основе логические операции, ученые определили рапамицин и синий свет как входные сигналы, а ориентацию клеток или созревание фокальной адгезии как выходные данные. Было обнаружено, что система с двойной регулировкой функционировала как комбинаторная логическая схема, состоящая из логических элементов «И» и «НЕ» (4A), когда рапамицин был первым сигналом, а синий свет был вторым. В этом эксперименте, хоть рапамицин и присутствовал в клеточной культуре во время конфокальной визуализации, синий свет был способен изменять конформацию Src и противодействовать эффектам, индуцированным рапамицином. Следовательно, синий свет может быть более доминирующим в контроле конформаций Src, чем рапамицин.


Изображение №5

Чтобы проверить данную гипотезу, ученые изменили синхронизацию входных сигналов, в которых сначала использовался синий свет, а позже добавлялся рапамицин. При облучении синим светом угол ориентации клеток и клеточная динамика значительно увеличивались (5B и 5C; видео ниже).

Видео №3

Когда был добавлен рапамицин, угол ориентации клеток и динамика значительно уменьшились, независимо от применения синего света. Углы популяции были даже меньше, чем у необработанных клеток, а клеточная динамика восстанавливалась до исходного состояния. На основании этих двух экспериментов можно сделать вывод, что LOV2 и uniRapR играют эквивалентные роли во влиянии на конформационную динамику Src.


Изображение №6

Ученые отмечают, что электронными логическими схемами можно гибко управлять (включать/выключать), сохраняя при этом высокую надежность. Чтобы выяснить, способна ли разработанная биологическая система к обратимому переключению, ученые провели продолжительный эксперимент (~15 часов), в котором синий свет включался и выключался каждые 3 часа в присутствии рапамицина.

Было обнаружено, что угол ориентации клеток, а также прирост и потеря апексов уменьшались, когда присутствовал только рапамицин (первый ряд на 6A; левая панель на 6B). Напротив, наклон клеток и клеточная динамика увеличивались при облучении синим светом.

Для дальнейшего подтверждения цикличности использовался синий свет вместо добавления рапамицина (второй ряд на 6A; и правая панель на 6B). Клеточный угол и динамика немного увеличились при облучении синим светом. После добавления рапамицина и выключения синего света клеточный угол и динамика значительно уменьшились. Позднее облучение синим светом изменило клеточный фенотип и увеличило клеточный угол и динамику. В конце концов, когда снова был выключен синий свет, клеточный угол и динамика значительно уменьшились. Следовательно, манипулируя входными сигналами, вполне возможно обратимо генерировать выходные реакции включения/выключения.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые рассказали о создании первого в мире нанокомпьютерного агента на основе белка, способного управлять поведением клеток.

Спроектированный белок реагировал на определенные сигналы (входные данные) и производил соответствующие действия (выходные сигналы). Манипулирование входными сигналами позволяет получать различные желаемые выходные сигналы, тем самым получить контроль над поведением клеток.

Супер-белок был создан посредством внедрения в него двух сенсорных доменов, которые реагируют на раздражители (синий свет и рапамицин). В ответ на эти раздражители данные домены меняют свою ориентацию и положение в пространстве. Во время практических испытаний разработанный белок помещался в живые клетки. Затем ученые использовали разные последовательности и комбинации раздражителей и проверяли, меняется ли ориентация клеток в ответ на них. Как выяснилось, если сначала обнаруживается рапамицин, а затем свет, клетка примет один угол ориентации. Если же сначала идет свет, а потом рапамицин, клетка примет другой угол ориентации.

Авторы разработки заявляют, что увеличение числа входных сигналов, которые будет воспринимать нанокомпьютерный агент, приведет к получению более широкого спектра реакционных действий клеток. Следовательно, контроль над клеткой может быть достаточно обширным.

Ученые намерены продолжить свое исследование, дабы усовершенствовать свое творение, которое может быть весьма полезным в рамках клеточной терапии различных недугов, от аутоиммунных и вирусных заболеваний до диабета, рака и даже поврежденных нервов.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?