Эволюция — это путь, которые пришлось преодолеть всем живым существам на планете Земля. Данный процесс протекает медленно и дает самые разные результаты в зависимости от вида, а именно от его физиологии, места обитания, потенциальных хищников и потенциальной пищи. Несмотря на разительные отличия между видами, эволюция каждого из них имеет общую цель — выживание. Тем не менее эволюция, будучи довольно логичным процессом, не лишена случаев, когда определенные системы у разных видов проходят схожий, а порой и одинаковый эволюционный путь. Стрекозы, к примеру, являются одними из лучших хищных насекомых. Они прекрасно летают, быстро реагируют на любые визуальные сигналы, будь то опасность, пища или потенциальный партнер. Их зрение по сравнению с нашим намного лучше, особенно в восприятии чрезвычайно глубокого красного света. Ученые из Осакского университета (Япония) установили, что данная способность стрекоз и зрение человека обладают общими корнями. Что именно общего между зрением человека и стрекозы, и как данное открытие может помочь в лечении заболеваний глаз? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Опсины, члены семейства G-белковых рецепторов (GPCR от G protein coupled receptor), связываются с хромофором ретиналем, образуя фоточувствительные пигменты (опсиновые пигменты) для зрительной и незрительной функций животных. Спектры поглощения опсиновых пигментов настраиваются от UV (УФ) до красной области в зависимости от аминокислотных остатков, окружающих хромофор, что лежит в основе спектральной чувствительности различных фоторецепторов. Разнообразие спектральной чувствительности особенно важно для цветового зрения. У некоторых животных цветовое зрение включает восприятие красного света (красное зрение), достигающего 700 нм, которое многократно эволюционировало в животном царстве. Красное зрение в основном достигается за счет опсинов, чувствительных к длинноволновому излучению (LW от long-wavelength), которые независимо эволюционировали в разных линиях, и поэтому механизмы спектральной настройки могут различаться.

Спектроскопический анализ рекомбинантных пигментов на основе LW-опсина, экспрессируемых в культивируемых клетках, и их сайт-специфических и/или химерных мутантов позволил выявить аминокислотные остатки, ответственные за красное смещение спектров поглощения. Во многих LW-опсинах позвоночных, длина волны максимального поглощения (λ_max) которых составляет ~ 560 нм, связывание ионов хлорида с участком, включающим остаток гистидина в положении 181 (система нумерации бычьего родопсина), приводит к красному смещению λ_max на 15–45 нм, а аминокислотные остатки в положениях 289 и 292 также ответственны за хлоридный эффект в некоторых LW-опсинах млекопитающих. В LW-опсинах приматов (красных и зеленых опсинах), которые разошлись около 30 миллионов лет назад, разница в λ_max примерно в 30 нм между красными и зелеными опсинами объясняется заменами в позициях 164 (5 нм), 261 (10 нм) и 269 (17 нм). В LW-опсинах млекопитающих разница в λ_max примерно в 50 нм между красным человеческим опсином и зеленым мышиным опсином в основном объясняется заменой в позиции 292 (18 нм), а также в позиции 181 (28 нм).

Красное зрение также наблюдалось у некоторых членистоногих, таких как бабочки, стрекозы и ракообразные креветки-богомолы. В случае этих членистоногих чувствительность к красному цвету, имеющая пиковые длины волн до 700 нм, достигается за счет комбинации спектров поглощения LW-опсинов и фильтрующих пигментов, присутствующих в омматидиях сложных глаз. Поэтому выяснение спектров поглощения LW-опсинов особенно важно для понимания молекулярной основы красного зрения членистоногих. Однако из-за трудностей с экспрессией опсинов беспозвоночных в культивируемых клетках молекулярная основа красного зрения членистоногих, включая механизм красного сдвига, была изучена лишь в ограниченной степени.

Ученые разработали систему экспрессии в культивируемых клетках для опсинов беспозвоночных, и, используя эту систему, провели спектроскопический анализ рекомбинантного пигмента LW-опсина (PxRh3) бабочки-парусника Papilio xuthus, показав, что λ_max составляет ~ 570 нм. Кроме того, было экспериментально показано, используя спектроскопию гетерологического действия (HAS от heterologous action spectroscopy), что спираль III, в частности аминокислотные остатки в положениях 116 (+ 6 нм) и 120 (+ 3 нм), имеют решающее значение для красного смещения в PxRh3, демонстрируя иной механизм спектральной настройки по сравнению с LW-опсинами позвоночных.

Были также определены спектры поглощения LW-опсина у некоторых других членистоногих, при этом их λ_max варьируется от ~ 518 нм (Callophrys sheridanii) до ~ 578 нм (Arhopala. japonica) у чешуекрылых, 542 нм (RhLWD1) и 557 нм (RhLWA2) у стрекозы Sympetrum frequens, а также 539 нм (NoL6) и 611 нм (NoL14) у креветки-богомола Neogonodactylus oerstedii, хотя места спектральной настройки, а также механизмы, лежащие в основе их красного смещения, еще не выявлены.

Интересно, что у стрекоз LW-опсины чрезвычайно разнообразны. Ранее были исследованы только два LW-опсина, причем более длинный из них демонстрирует λ_max 557 нм, тогда как фотореакции фоторецепторных клеток у некоторых видов стрекоз показали пик чувствительности на ~ 600 нм. Эти факты позволяют предположить, что у стрекоз могут существовать LW-опсины, чувствительные к более длинным волнам. Кроме того, исследование LW-опсинов, чувствительных к свету с более длинными волнами, было бы ценным для оптогенетических применений, поскольку такой свет эффективно проникает в биологические ткани, обеспечивая эффективную фотоактивацию инструментов в более глубоких областях тела.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые систематически изучали спектральную чувствительность нескольких типов LW-опсинов стрекоз, чтобы понять механизм красного смещения в LW-опсинах стрекоз, эволюционировавших независимо от опсинов других животных, и разработать мощные оптогенетические инструменты. Ученым удалось провести спектроскопический анализ рекомбинантного пигмента Asiagomphus melaenops RhLWA2 (Am_RhLWA2) и выявить, что он имеет максимум поглощения при 580 нм и демонстрирует бистабильность. Это указывает на то, что Am_RhLWA2 является самым чувствительным к длинноволновому диапазону бистабильным красным опсином на сегодняшний день. Кроме того, было установлено, что позиция 292 отвечает за красное смещение в LW-опсинах стрекоз, демонстрируя параллельную эволюцию между LW-опсинами млекопитающих и насекомых. Также было обнаружено, что дальнейшее повышение чувствительности к красному диапазону происходит при замене на другую аминокислоту в линии стрекоз. Ученые также успешно модифицировали Am_RhLWA2 с красным смещением спектра и продемонстрировали значительные клеточные реакции культивируемых клеток, экспрессирующих Am_RhLWA2 с красным смещением спектра, на ближний инфракрасный (NIR от near-infrared) свет (738 нм), показав потенциал для использования в качестве NIR-чувствительного оптогенетического инструмента для контроля GPCR-сигнализации.

Результаты исследования

Первичный скрининг красных опсинов у стрекоз на основе гетерологической спектроскопии действия

Зрительные опсины насекомых филогенетически классифицируются на три группы, члены которых чувствительны к УФ-излучению, коротковолновому и длинноволновому свету соответственно. Комплексное исследование опсинов 12 видов стрекоз выявило 200 зрительных опсинов, и 136 опсинов относятся к LW группе насекомых, которая далее подразделяется на шесть подгрупп (LWA, LWB, LWC, LWD, LWE и LWF). Среди LW опсинов стрекоз RhLWA2 в подгруппе LWA и RhLWF1-4 в подгруппе LWF экспрессируются в вентральной области глаз взрослых особей Sympetrum frequens, где были зарегистрированы электрофизиологические реакции на длинноволновый свет. Поэтому ученые сосредоточились на пяти LW-опсинах как на кандидатах на самые длинноволновые LW-опсины, так называемые красные опсины.

Поскольку экспрессия и очистка рекомбинантных фотопигментов опсинов членистоногих в культивируемых клетках часто не удается, ученые применили спектроскопию гетерологического действия (HAS от heterologous action spectroscopy), основанную на светоиндуцированном увеличении уровня cAMP в культивируемых клетках, экспрессирующих Gs-связанные опсины, при каждом цвете света с одинаковым числом фотонов, чтобы приблизительно оценить спектральную чувствительность LW-опсинов стрекозы.

Изображение №1

Для HAS ученые создали Gs-связанные мутанты Sympetrum frequens RhLWA2 (Sf_RhLWA2) и RhLWF1-4 (Sf_RhLWF1-4), в которых третья цитоплазматическая петля была заменена на петлю Gs-связанного опсина медузы (1A). Была проведена упрощенная версия HAS, используя две длины волны света на этом первоначальном скрининге. Ученые выбрали 510 нм и 630 нм, которые, как ожидается, вызовут аналогичный уровень светоиндуцированного увеличения cAMP, принимая λ_max ~ 575 нм в качестве эталона для LW-опсинов (1B). В результате, Gs-связанный Sf_RhLWA2 продемонстрировал аналогичный уровень увеличения cAMP для обеих длин волн света, как и Gs-связанный опсин LW бабочки (PxRh3), тогда как Gs-связанный Sf_RhLWF1-4 показал гораздо более высокое увеличение cAMP для света с длиной волны 510 нм. Это убедительно свидетельствует о том, что λ_max RhLWA2 является наибольшей среди длинноволновых опсинов стрекоз (1C).

Ученые также исследовали спектральную чувствительность RhLWA1, поскольку они тесно связаны с RhLWA2 в молекулярном филогенетическом дереве, и они высоко экспрессируются у стрекоз на стадии личинок. HAS показал, что культивируемые клетки, экспрессирующие Gs-связанный Sf_RhLWA1, демонстрировали значительную реакцию на свет с длиной волны 630 нм. Однако амплитуда была меньше, чем на свет с длиной волны 510 нм (1C). Это позволяет предположить, что λ_max RhLWA1 больше, чем у RhLWF1-4, но короче, чем у RhLWA2. Это позволяет рассматривать RhLWA2 как красные опсины у стрекоз.

Затем ученые исследовали RhLWA2, показавший наибольшее увеличение cAMP, что указывает на высокий уровень экспрессии в культивируемых клетках среди RhLWA2 12 видов стрекоз. В результате было обнаружено, что культивируемые клетки, экспрессирующие Gs-связанную версию RhLWA2 Asiagomphus melaenops (Am_RhLWA2), демонстрировали гораздо более сильную световую реакцию по сравнению с Gs-связанными RhLWA2 других стрекоз (1D), что позволяет проводить дальнейшие исследования с Am_RhLWA2.

Спектр поглощения Am_RhLWA2 и участки спектральной настройки для красного смещения

Изображение №2

Ученые экспрессировали Am_RhLWA2 в культивируемых клетках и успешно получили рекомбинантный пигмент Am_RhLWA2. Спектроскопический анализ показал, что Am_RhLWA2 демонстрирует максимум поглощения при 580 нм в темноте, что длиннее, чем у PxRh3 бабочек (2A). Следует отметить, что аппроксимирующая кривая не совсем точно соответствует фактическому спектру поглощения в коротковолновой области, поскольку рассеяние влияет на спектры поглощения в этой области, особенно в образцах с низкой концентрацией.

Затем был проведен подробный анализ спектроскопических свойств Am_RhLWA2. Облучение Am_RhLWA2 красным светом привело к уменьшению и увеличению поглощения в области 640 нм и около 550 нм соответственно (2B). Изменение спектра под воздействием светового облучения объясняется превращением темного состояния в фотопродукт со смещенным в синюю область спектром поглощения. Последующее облучение зеленым светом вызвало обратную реакцию, что указывает на обратное превращение фотопродукта в темное состояние. Второе облучение красным светом привело к изменению спектра, которое являлось зеркальным отражением изменений, вызванных первым и вторым облучением зеленым светом. Фотореакция явно соответствует критериям бистабильных опсинов, которые превращаются в стабильные фотопродукты при поглощении света, а фотопродукты возвращаются в исходное темное состояние при последующем поглощении света.

Кроме того, был также проведен HPLC анализ для изучения изомеризации ретиналя в Am_RhLWA2 под воздействием светового облучения. В соответствии с зеркально-симметричными разностными спектрами, изомеризация 11-цис в полностью транс и полностью транс в 11-цис наблюдалась под действием красного света, преимущественно поглощаемого тёмным состоянием, и зелёного света, преимущественно поглощаемого фотопродуктом, соответственно (2C). Эти результаты ясно продемонстрировали, что Am_RhLWA2 является бистабильным красным опсином.

Далее были исследованы аминокислотные остатки, ответственные за красный сдвиг RhLWA2 по сравнению с RhLWF1–4, которые обладают более коротковолновой чувствительностью (1C), чтобы понять механизм спектральной настройки в LW-опсинах стрекоз. Культивируемые клетки, экспрессирующие другие типы LW-опсинов, RhLWF1-4, демонстрировали значительную реакцию на свет с длиной волны 540 нм, в то время как на свет с длиной волны 630 нм реакция была незначительной (1C). Профили HAS RhLWF1-4 аналогичны профилям PxRh1 с λ_max ~ 540 нм. Это предполагает, что их значения λ_max находятся около ~ 540 нм в зеленой области.

Затем ученые сравнили аминокислотные остатки, расположенные в пределах 5 Å от хромофора ретиналя, которые могут играть значительную роль в спектральной настройке между RhLWA2 и RhLWF1-4, чтобы найти остатки, ответственные за красное смещение RhLWA2. Для этой цели ученые вывели эти остатки из кристаллической структуры родопсина прыгающего паука (6I9K), который тесно связан с опсинами стрекозы. Сравнение показало, что позиции 114, 186 и 292 заняты взаимоисключающими аминокислотами в RhLWA2 и RhLWF1-4 (2D). Был проведен спектроскопический анализ мутантов Am_RhLWA2 в этих позициях, содержащих аминокислотные остатки из RhLWF1-4. В результате, хотя мутанты G114A и S186A не образовывали функциональные фотопигменты, наблюдался явный спектр поглощения для мутанта V292. Примечательно, что λ_max мутанта V292S составляет 546 нм, что аналогично расчетному λ_max RhLWF1-4, демонстрируя, что замена в позиции 292 объясняет большую часть спектрального сдвига между Am_RhLWA2 и RhLWF1-4 (2E). Интересно, что среди RhLWA2 стрекоз только Am_RhLWA2 имеет валин в позиции 292, тогда как RhLWA2 других видов стрекоз имеют аланин (2D). Мутант Am_RhLWA2, имеющий аланин в позиции 292 (V292A), демонстрировал спектр поглощения с λ_max на уровне 562 нм, что на 16 нм длиннее, чем λ_max мутанта V292S, и на 18 нм короче, чем λ_max дикого типа (2E, 2F). Эти результаты показали, что позиция 292 играет ключевую роль в спектральной настройке RhLW, и Am_RhLWA2 является особенно чувствительным к длинным волнам.

Разработка красных опсинов с красным смещением и чувствительных к ближнему инфракрасному излучению инструментов GPCR

Помимо своей биологической значимости, родопсины стали мощными инструментами оптогенетики — метода, который генетически вводит светочувствительные белки в целевые клетки и манипулирует клеточной активностью с помощью света, особенно в нейронных клетках, где гены родопсина генетически экспрессируются. Хорошо известно, что свет с большей длиной волны может проникать глубже в биологические ткани. Поэтому чувствительные к длинной волне инструменты имеют большое преимущество для неинвазивного и эффективного оптического контроля физиологических реакций в более глубоких тканях. Учитывая эти преимущества, ученые поставили перед собой цель разработать красные опсины с более дальним красным смещением по сравнению с нативными для оптогенетических применений, чувствительных к ближнему инфракрасному излучению (NIR), и понять потенциал красной чувствительности животных опсинов. Затем они ввели аминокислотные замены, вызывающие красное смещение в красных опсинах других животных, в Am_RhLWA2 и провели спектроскопический анализ (3A).

Изображение №3

К сожалению, однако, Am_RhLWA2, имеющий мутации в местах красного смещения человеческого красного опсина (OPN1LW) (181, 261, 269) и PxRh3 бабочки (116, 120), не демонстрировал никаких спектров поглощения, полученных из рекомбинантных пигментов, вероятно, из-за их низкого уровня экспрессии в культивируемых клетках и/или низкой стабильности в детергенте из-за мутаций. В LW-опсинах креветок-богомолов места красного смещения не были определены, но сравнение аминокислот в пределах 5 Å от хромофора между чувствительным к зеленому цвету NoL6 и чувствительным к красному цвету NoL14 показало, что позиции 90, 118, 208, 211 и 212 могут быть кандидатами на места красного смещения (3A). Поскольку аминокислоты в позициях 90, 118 и 212 были общими для NoL14 и Am_RhLWA2, ученые заменили аминокислоты в позициях 208 и 211 в Am_RhLWA2 на аминокислоты из NoL14. Хотя мутант S208T демонстрировал спектр поглощения, существенно не отличающийся от спектра дикого типа Am_RhLWA2 (3B), мутант V211C демонстрировал значительно смещенный в красную область спектр (3C). На основе номограммы родопсина λ_max мутанта V211C составляет 590 нм, что демонстрирует успешное конструирование красных опсинов для дальнейшего смещения в красную область путем введения «гетерологичной» мутации.

Изображение №4

Затем ученые исследовали оптогенетический потенциал красных опсинов стрекозы для оптогенетических инструментов, чувствительных к ближнему инфракрасному излучению и GPCR. Поскольку зрительные опсины насекомых, как известно, являются преимущественно Gq-связанными опсинами, ученые измерили повышение внутриклеточного уровня Ca²⁺, вызванное светом с длиной волны 738 нм, в культивируемых клетках, экспрессирующих красные опсины стрекозы, при различной интенсивности света. Анализ с использованием экворина, который определяет внутриклеточные уровни Ca²⁺ как уровни люминесценции, показал, что культивируемые клетки, экспрессирующие Am_RhLWA2 дикого типа или мутант V211C, демонстрировали значительную реакцию Ca²⁺ на свет с длиной волны 738 нм, тогда как клетки, экспрессирующие Rh1 паука-скакуна (SpiRh1), модель Gq-связанного бистабильного опсина, такой реакции не показывали (4A). Примечательно, что амплитуда ответа культивируемых клеток, экспрессирующих мутант Am_RhLWA2 V211C, была до десяти раз больше, чем у клеток дикого типа (4B). Это ясно демонстрирует высокую эффективность мутанта Am_RhLWA2 с красным смещением для света большей длины волны. В отличие от этого, стимуляция светом с длиной волны 536 нм вызывала большее повышение внутриклеточного уровня Ca²⁺ в культивируемых клетках, экспрессирующих Am_RhLWA2, чем в клетках, экспрессирующих мутант Am_RhLWA2 V211C, что указывает на смещенную чувствительность мутанта V211C к свету большей длины волны, что согласуется с их спектрами поглощения (4C и 4D). Эти результаты предоставляют перспективные инструменты, чувствительные к ближнему инфракрасному излучению, для контроля внутриклеточного уровня Ca²⁺.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые уделили особое внимание глазам стрекоз, а именно тому, как они воспринимают красный свет.

Зрение человека основано на белках в глазу, называемых опсинами. Эти белки позволяют нам воспринимать разные цвета. У нас есть три основных типа, каждый из которых настроен на синие, зеленые или красные длины волн, которые вместе обеспечивают полноценное цветное зрение. Стрекозы выделяются среди насекомых своей способностью воспринимать красный свет. Авторы исследования идентифицировала у стрекоз специфический опсин, который реагирует на свет с длиной волны около 720 нм. Эта длина волны находится за пределами самого глубокого красного спектра, который обычно видят люди. Следовательно, это делает зрение стрекоз самым чувствительным к красному свету из когда-либо исследованных.

Ученые предположили, что эта повышенная чувствительность помогает стрекозам находить партнеров. Чтобы проверить эту идею, они изучили отражательную способность, которая показывает, сколько света отражает поверхность. У стрекоз отраженный свет играет ключевую роль в том, как особи выглядят друг для друга. Их измерения выявили явные различия между самцами и самками в том, как они отражают красный и ближний инфракрасный свет. Это говорит о том, что самцы могут полагаться на эти тонкие визуальные сигналы, чтобы быстро идентифицировать самок во время полета.

Как отмечают ученые, механизм, с помощью которого красный опсин стрекозы обнаруживает красный свет, идентичен механизму красного опсина у млекопитающих, включая человека. Это неожиданный результат, предполагающий, что один и тот же эволюционный процесс происходил независимо в отдаленно родственных линиях.

Ученые также обнаружили ключевую деталь, которая может сделать это открытие полезным в технологиях и медицине. Они определили единственное положение в белке опсина, которое определяет его реакцию на свет. Модифицируя это положение, они смогли сместить чувствительность белка дальше в сторону более длинных волн, приблизив его к инфракрасному диапазону. Затем они разработали версию белка, реагирующую на еще более длинные волны, и продемонстрировали, что клетки, содержащие этот модифицированный опсин, могут быть активированы ближним инфракрасным светом.

Эта работа может быть особенно ценной в оптогенетике — области, использующей светочувствительные белки для контроля и изучения клеток в живых тканях. Поскольку более длинные волны света могут проникать глубже в организм, белок, реагирующий на ближний инфракрасный свет, может позволить ученым достигать клеток, к которым иным образом трудно получить доступ.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?