17.07.2026 13:01
Bright_Translate 0 2100 Источник

Я уже пять раз секвенировал свой геном с помощью портативного секвенатора MinION, разработанного Oxford Nanopore Technologies. Этот процесс включает взятие мазка, его подготовку, пропуск через секвенатор и последующий анализ. Для этой задачи хорошо подходит буккальный эпителий (клеточная ткань внутренней поверхности щёк) — он легко доступен и быстро восстанавливается. Однако эти ткани не подходят для диагностики рака, выявления воспалений или оценки экспрессии генов в других частях тела. Например, если у вас сыпь на груди и вы хотите узнать, какие гены экспрессируются в воспалённых клетках, вам нужно собирать именно эти проблемные клетки и сравнивать с их здоровыми образцами.

Для секвенирования клеток я купил специальный лабораторный материал и расходники. Мне пришлось около двух месяцев собирать всё необходимое, чтобы выполнить качественный процесс от и до. К тому же, стоит это всё очень дорого для рядового человека, хотя цены снижаются (причём экспоненциально!). Так что в будущем мы получим вполне доступную технологию — как это было с сотовыми телефонами или ИИ — которая позволит нам в реальном времени узнавать экспрессию генов ДНК и РНК.

А что мне даст знание своего генома?

Прежде чем тратить кучу денег и времени на секвенирование, нужно ответить на вопрос, а что вообще нам даст изучение своего генома?

Сам по себе геном — это не какая-то магия, а фундаментальный справочный слой для всего организма. Как только я получу файл VCF (формат вызова вариантов), то смогу прогнать его через различные инструменты вроде VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB (очень рекомендую), Gene Inspector или Claude и начать задавать вопросы типа:

  • Какие у меня есть генетические варианты?

  • Какие гены и метаболические пути затронуты?

  • Какие лекарства мой организм может усваивать нестандартно?

  • На какие редкие варианты мне следует обратить внимание?

  • В каких областях модель ещё пока ничего не знает?

И последний пункт очень важен. Он говорит о том, что полученная информация пока не является медицинским диагнозом. И здесь явно нельзя действовать в духе «Пойду отредактирую себя с помощью CRISPR, потому что так посоветовал ИИ». Основная ценность заключается в том, чтобы превратить статичный геном в интерактивную базу данных, к которой можно делать запросы. Но позже наверняка появится и возможность редактирования через CRISPR. ДНК — это стабильная матрица, РНК — текущее состояние организма, и со временем мы объединим данные всех биосенсоров в единую «модель» своего тела.

Вот вам полезный список справочных ссылок и постов в Twitter*:

  • Анализ генетических вариантов на основе фундаментальных законов природы: пост пользователя Adib @ ICML в X.

  • Кратко: эти гены и их комбинации приводят к реальным физическим недугам. И в ближайшие десять лет мы наверняка уже составим полный каталог этих взаимосвязей.

  • Передайте ваш геном и РНК на анализ любой из моделей с ресурса Biotender: https://www.biotender.online/bio-model-install-guide/

  • Покажите свой геном Claude Code. Отпишите мне, если нужна помощь в настройке.

  • Обязательно сообщайте докторам, если ваш организм как-то по-особенному усваивает те или иные препараты.

  • Статья Патрика Коллисона на тему использования агентов для интерпретации и анализа геномных данных.

Этапы протокола

Информации здесь очень много — можете изучить её сами или скормить ИИ. Не стесняйтесь просто скопировать ссылку на эту страницу и попросить ChatGPT разъяснить вам все шаги. Ещё лучше, если у вас есть AR-очки — тогда ИИ сможет буквально провести вас за руку через все этапы выполнения протокола.

Оборудование

  • Oxford Nanopore Technologies MinION ($7.5k).

  • Ноутбук/рабочая станция для MinKNOW (сгодится любой ПК).

  • 100+ ГБ пространства для хранения результатов.

  • GPU для перевода сигналов в текст через Dorado.

  • Vortex ($50).

  • Термоблок ($250).

  • Центрифуга ($400 подержанная на eBay).

Расходные материалы

Реагенты

  • Набор для извлечения ДНК:

    • Набор NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit для выделения высокомолекулярной ДНК из клеток и крови ($87 за 5 запусков):

      • буфер для подготовки ядер (Nuclei Prep Buffer),

      • буфер для лизиса ядер (Nuclei Lysis Buffer),

      • РНКаза А (RNase A),

      • протеиназа K (Proteinase K),

      • усилитель осаждения (Precipitation Enhancer),

      • бусины для захвата ДНК (DNA Capture Beads),

      • буфер для промывки гДНК (gDNA Wash Buffer),

      • буфер для элюции II (Elution Buffer II),

      • фиксаторы шариков и сборные пробирки.

  • Реактивы для подготовки библиотек ДНК:

    • Cопутствующий модуль NEBNext Companion Module v2 / реагенты для репарации и подготовки концов ДНК ($760 за 24 реакции):

      • буфер для репарации FFPE ДНК (FFPE DNA Repair Buffer),

      • смесь для репарации FFPE ДНК (FFPE DNA Repair Mix),

      • Реакционный буфер для подготовки концов Ultra II (Ultra II End-prep Reaction Buffer),

      • Ферментная смесь для подготовки концов Ultra II (Ultra II End-prep Enzyme Mix),

      • Быстрая ДНК-лигаза Т4 NEBNext (NEBNext Quick T4 DNA Ligase).

    • Набор Oxford Nanopore SQK-LSK114 ($720 за 6 реакций):

      • буфер для длинных фрагментов (LFB),

      • буфер для элюции (EB),

      • адаптер для лигирования (LA),

      • буфер для лигирования (LNB),

      • буфер для секвенирования (SB),

      • шарики для библиотеки (Library Beads, LIB),

    • Реактивы для прайминга проточной ячейки (Flow cell priming reagents):

      • раствор для промывки проточной ячейки (Flow Cell Flush, FCF),

      • фиксатор для проточной ячейки (Flow Cell Tether, FCT),

      • бычий сывороточный альбумин (BSA),

    • магнитные шарики AMPure XP (AMPure XP beads),

    • 80%-й этанол,

    • вода, свободная от нуклеаз ($32 за 25 мл).

  • Измерение количества ДНК:

    • флуориметр Qubit,

    • набор реактивов Qubit dsDNA BR/HS Assay Kit для анализа двухцепочечной ДНК (широкого диапазона [BR] или высокой чувствительности [HS]).

Лабораторное оборудование

  • Микроцентрифуга,

  • Вортекс,

  • Тремостат / твердотельный термостат (Heat block),

  • Магнитный штатив для пробирок 1,5 и 2 мл (Magnetic rack),

  • Штативы для пробирок,

  • Ведёрко для льда / охлаждающий блок,

  • Морозильная камера с температурой -20°C,

  • Холодильник с температурой 4°C,

  • Дозаторы (Pipettes):

    • P1000 (100—1000 мкл),

    • P200 (0—200 мкл),

    • P20 (2—20 мкл),

    • P10 (1-10 мкл).

Пластик и профессиональные лабораторные материалы

  • Cтерильные флокированные зонды для буккального мазка (flocked cheek swabs).

  • Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл.

  • Микроцентрифужные пробирки 2,0 мл.

  • Пробирки DNA LoBind на 1,5 мл (DNA LoBind 1.5 mL tubes).

  • Пробирки RNA LoBind (RNA LoBind tubes).

  • ПЦР-пробирки 0,2 мл.

  • Пробирки для анализа на флуориметре Qubit (Qubit assay tubes).

  • Стерильные наконечники с фильтром для дозаторов (Pipette sterile filtered tips):

    • P1000 (100—1000 мкл).

    • P200 (0—200 мкл).

    • P20 (2—20 мкл).

    • P10 (1-10 мкл).

  • Наконечники с широким носиком P200 (Wide-bore P200 tips).

  • Лабораторный маркер и этикетки для пробирок.

  • Перчатки.

Программное обеспечение

  • MinKNOW,

  • Dorado,

  • minimap2,

  • samtools,

  • mosdepth,

  • NanoPlot or pycoQC,

  • Clair3,

  • DeepVariant, не обязательно,

  • Ensembl VEP,

  • ClinVar,

  • gnomAD,

  • PharmGKB,

  • dbSNP, не обязательно,

  • Python/R,

  • SQLite/Postgres для последующих запросов.

Комплексный протокол секвенирования ДНК

Цель — пройти весь путь от двух мазков со щеки до их секвенирования на приборе MinION.

0. Подготовка

  • Наденьте перчатки.

  • Очистите рабочее место.

  • Промаркируйте пробирки:

    • Cheek sample (проба со щеки),

    • Extracted DNA (извлечённая ДНК),

    • End-prep (подготовка концов ДНК),

    • Ligation (лигирование),

    • Final library (готовая библиотека),

    • Priming mix (смесь для прайминга),

    • Loading mix (смесь для загрузки).

  • Нагрейте магнитные шарики AMPure XP до комнатной температуры.

  • Держите ферментные смеси в холоде.

  • Настройте термоблок на 56°C.

  • Держите буфер для подготовки ядер (Nuclei Prep Buffer) в холоде.

  • Убедитесь, что в буфер для промывки геномной ДНК (gDNA Wash Buffer) уже добавлен этанол.

  • Проверьте наличие изопропанола, он понадобится для связывания ДНК.

  • Убедитесь, что у вас есть свежеприготовленный 80% этанол для очистки ДНК на шариках AMPure.

  • Убедитесь, что у вас подготовлены все необходимые реагенты от ONT:

  • буфер для репарации (FFPE DNA Repair Buffer v2),

  • смесь для репарации (FFPE DNA Repair Mix),

  • ферментная смесь для подготовки концов (N-Prep Enzyme Mix),

  • солевая лигаза T4 для сшивания (Salt-T4 DNA Ligase),

  • буфер для лигирования (LNB),

  • адаптер для лигирования (LA),

  • буфер для длинных фрагментов (LFB),

  • буфер для элюции (EB),

  • буфер для секвенирования (SB),

  • шарики для библиотеки (LIB),

  • раствор для промывки проточной ячейки (FCF),

  • фиксатор для проточной ячейки (FCT).

1. Взятие мазка со щеки

Цель: собрать как можно больше клеточного материала в раствор PBS:

  • Прополощите рот водой.

  • Подождите 10 минут.

  • Не чистите зубы.

  • Не используйте ополаскиватель для рта.

  • С усилием потрите внутреннюю часть щеки зондом в течение 60 секунд.

  • Влейте в пробирку «Cheek sample» 1 мл охлаждённого раствора PBS.

  • Поместите кончик зонда в PBS.

  • Вортексируйте в течение 10 секунд.

  • Отожмите зонд об стенки пробирки.

  • Извлеките и выбросите зонд.

Как выглядит успешный результат:

Допускается помутнение раствора PBS.

2. Осаждение клеток

Цель: сконцентрировать клетки на дне пробирки и удалить излишки PBS.

  • Центрифугируйте образец с ускорением 2 000 × g в течение 30 секунд.

  • На дне пробирки должен образоваться небольшой белый или сероватый осадок.

  • Удалите основную часть раствора с помощью дозатора P1000.

  • Аккуратно удалите оставшийся с помощью дозатора P200.

  • Оставьте около 50-100 мкл над осадком.

  • Слегка постучите пальцем по пробирке, чтобы ресуспендировать осадок.

Важно: не засасывайте дозатором сам осадок.

3. Приготовление лизирующих растворов Monarch для одного образца

Раствор для подготовки ядер

165 мкл буфера для подготовки ядер (Nuclei Prep Buffer);
5,5 мкл РНКазы А (RNase A).

Аккуратно перемешайте. Держите в холоде. Для эксперимента понадобится 150 мкл.

Раствор для лизиса ядер

165 мкл буфера (Nuclei Lysis Buffer)
11 мкл Протеиназы К (Proteinase K)

Аккуратно перемешайте. Держите при комнатной температуре. Для эксперимента понадобится 150 мкл.

В инструкцию намеренно заложен дополнительный объём, чтобы компенсировать возможную неточность дозирования.

4. Лизис клеток

Цель: вскрыть оболочки клеток и расщепить белки с сохранением длинной геномной ДНК.

  • Добавьте к осаждённым клеткам 150 мкл раствора для подготовки ядер.

  • Аккуратно наберите этот раствор в пипетку и вылейте 10 раз.

  • Выдержите образец 2 минуты при комнатной температуре.

  • Внесите 150 мкл раствора для лизиса ядер.

  • Аккуратно переверните пробирку 10 раз.

  • Не вортексируйте.

  • Выдержите её при 56°C в течение 10 минут.

Как должен выглядеть успешный результат:

Жидкость в пробирке станет более тягучей.

Важно: не вортексируйте раствор после лизиса. На этом этапе главное — сохранить высокомолекулярную структуру ДНК.

5. Связывание ДНК с бусинами Monarch

Цель: обеспечить осаждение геномной ДНК на крупных бусинах для его захвата.

  • Влейте в пробирку 75 мкл усилителя осаждения (Precipitation Enhancer).

  • Аккуратно переверните её 8-10 раз.

  • Внесите 2 бусины для захвата (DNA Capture Beads).

  • Добавьте 275 мкл изопропанола.

  • Медленно переверните пробирку 30 раз.

  • Не вортексируйте.

Важно: теперь ДНК находится на бусинах. Не потеряйте их и не используйте на этом этапе этанол.

6. Промывка бусин с ДНК

Цель: смыть с бусин все загрязнения, сохранив на них ДНК.

  • Дайте бусинам осесть на дно пробирки.

  • Осторожно удалите жидкость, оставив в пробирке только бусины.

  • Добавьте 500 мкл буферного раствора для промывки гДНК (gDNA Wash Buffer).

  • Аккуратно переверните пробирку 2-3 раза.

  • Осторожно удалите промывочный буфер дозатором.

  • Добавьте ещё 500 мкл буферного раствора для промывки.

  • Аккуратно переверните пробирку 2-3 раза.

  • Осторожно удалите промывочный буфер.

  • Максимально удалите остатки жидкости, не затрагивая бусины.

Важно: в буферный раствор уже должен быть добавлен этанол.

7. Элюция геномной ДНК

Цель: снять очищенную геномную ДНК с бусин.

  • Вставьте ретейнер (bead retainer) в сборную пробирку Monarch.

  • Перенесите или просто пересыпьте бусины в этот ретейнер.

  • Выполните импульсное центрифугирование не дольше одной секунды.

  • Перенесите бусины в чистую пробирку Monarch.

  • Добавьте 100 мкл буферного раствора для элюции II (Elution Buffer II).

  • Выдержите при 56°C в течение 5 минут.

  • Установите ретейнер поверх чистой пробирки DNA LoBind с маркировкой «Extracted DNA».

  • Перенесите полученную жидкость вместе с бусинами в ретейнер.

  • Центрифугируйте при 12 000 × g в течение 30 секунд.

  • Сохраните полученную жидкость (элюат).

Полученный элюат и является очищенной гДНК. Ни в коем случае его не выбрасывайте.

8. Измерение количества ДНК флюориметром

Цель: измерить, достаточно ли ДНК, чтобы приступать к подготовке библиотеки ONT.

Компоненты:

Набор 1x dsDNA High Sensitivity (HS)

Если вы используете уже готовый реагент 1X, не выбирайте в меню прибора старый протокол, который шёл без пометки «1X».

Стандарты

Стандарт №1:

190 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS;
10 мкл калибровочного раствора «Standard #1».

Стандарт №2:

190 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS;
10 мкл калибровочного раствора «Standard #2».

Измерение образца, первая попытка

198 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS
2 мкл ДНК

На приборе Qubit введите:

Sample volume = 2 µL

Если концентрация оказалась слишком низкой

Используйте большее количество ДНК, приготовив смесь в новой пробирке Qubit:

190 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS
10 мкл ДНК

На экране Qubit введите:

Sample volume = 10 µL

Только не пытайтесь просто долить 8 мкл ДНК в старую пробирку (где уже налито 198 + 2 мкл). В таком случае общий объём смеси составит 208 мкл, что полностью нарушит математические алгоритмы расчёта прибора.

Запишите результат:

Концентрация геномной ДНК (Genomic DNA concentration):
Остаточный объём ДНК (Remaining DNA volume):
Расчётное общее количество ДНК (Estimated total DNA):

Посчитайте:

Общее количество ДНК (нг) = концентрация по Qubit (нг/мкл) × остаточный объём (мкл).

Пауза

Это лучший момент, чтобы сделать перерыв в рамках одного дня. 

Уберите извлечённую ДНК в холодильник (храните при 4°C).

Перед этим:

  • Убедитесь, что ДНК находится в маркированной пробирке DNA LoBind.

  • Выполните быстрое центрифугирование.

  • Не вортексируйте.

  • Плотно закройте.

  • Уберите в холодильник.

По возвращении переходите к этапу 9.

9. Дозирование исходной ДНК перед этапом репарации

Цель: подготовить 47 мкл раствора исходной ДНК.

Идеальный целевой показатель:

1,000 нг ДНК в объёме 47 мкл.

Посчитайте:

Необходимый объём ДНК = 1000 нг / Концентрация по Qubit (нг/мкл).

Затем:

Объём воды = 47 мкл — Необходимый объём ДНК.

Если раствор с ДНК слишком разбавленный, и 1 000 нг не помещается в 47 мкл, используйте максимально возможный объём:

47 мкл извлечённой ДНК;
0 мкл воды.

Пример для первого запуска с малым количеством ДНК:

0,296 нг/мкл × 47 мкл = ~13.9 нг ДНК.

Это количество было гораздо ниже рекомендуемой нормы, но запуск всё равно оказался полезен в качестве тренировочного прогона всей цепочки процесса.

10. Репарация / подготовка краёв

Цель: восстановить повреждённую ДНК и подготовить её края к прикреплению адаптеров.

Используйте строго реагенты v2:

Буферный раствор для репарации (FFPE DNA Repair Buffer v2)
Смесь ферментов для репарации (FFPE DNA Repair Mix)
Ферментная смесь для подготовки концов (N-Prep Enzyme Mix / Ultra II End Prep Enzyme Mix)

Важно: на этом этапе нельзя использовать солевую лигазу Salt-T4 DNA Ligase. Она пригодится позднее.

Если вы не используете контрольную ДНК (DCS, DNA Control Strand), замените необязательный 1 мкл DCS на 1 мкл воды, свободной от нуклеаз.

Компоненты для реакции

47 мкл раствора ДНК;
1 мкл воды без нуклеаз;
7 мкл FFPE DNA Repair Buffer v2;
2 мкл FFPE DNA Repair Mix;
3 мкл N-Prep Enzyme Mix.

Общий объём = 60 мкл

Этапы

  • Добавьте 47 мкл раствора ДНК в тонкостенную ПЦР-пробирку 0,2 мл с маркировкой «End-prep».

  • Добавьте 1 мкл воды, свободной от нуклеаз.

  • Добавьте 7 мкл FFPE DNA Repair Buffer v2.

  • Аккуратно пропипетируйте смесь 10-20 раз.

  • Добавьте 2 мкл FFPE DNA Repair Mix.

  • Пропипетируйте смесь 10-20 раз.

  • Добавьте 3 мкл N-Prep Enzyme Mix.

  • Снова пропипетируйте 10-20 раз.

  • Выполните быстрое центрифугирование.

Инкубация:

При 20°C в течение 5 минут.
При 65°C ещё 5 минут.
Затем поместите пробирку на лёд.

11. Очистка на магнитных шариках AMPure после репарации и подготовки краёв

Цель: очистить полученную ДНК после репарации и подготовки краёв.

Исходные материалы:

60 мкл реакционной смеси, полученной на предыдущем этапе.

Порядок действий:

  • Вортексируйте флакон со взвесью магнитных шариков AMPure XP, пока жидкость не станет равномерно коричневого цвета.

  • Добавьте 60 мкл взвеси AMPure XP к 60 мкл реакционной смеси.

  • Аккуратно пропипетируйте 10 раз.

  • Оставьте на 5 минут при комнатной температуре.

  • Поставьте пробирку на магнитный штатив.

  • Дождитесь полного осветления раствора.

  • Отберите дозатором и слейте весь супернатант, стараясь не задеть магнитные шарики.

Промывка 1

  • Не снимайте пробирку с магнита.

  • Добавьте 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола.

  • Удалите этанол дозатором.

Промывка 2

  • Добавьте ещё 200 мкл свежего 80% этанола.

  • Также удалите его.

Просушивание

  • Удалите остатки этанола дозатором P10 или P20.

  • Недолго подсушите осадок на воздухе (около 30 секунд).

  • Не пересушите.

  • Не допускайте растрескивания шариков.

Элюция

  • Снимите пробирку с магнитного штатива.

  • Добавьте 61 мкл воды, свободной от нуклеаз.

  • Аккуратно ресуспендируйте шарики.

  • Выдержите 5-10 минут при комнатной температуре.

  • Поместите пробирку обратно на магнит.

  • Дождитесь полного осветления раствора.

  • Перенесите 60 мкл чистого элюата в новую пробирку типа DNA LoBind с маркировкой «Ligation».

Важно: шарики в новую пробирку не переносите.

12. Лигирование адаптеров

Цель: прикрепить секвенирующие адаптеры Oxford Nanopore.

Компоненты:

LNB (буфер для лигирования);
LA (адаптер для лигирования);
Salt-T4 DNA Ligase (солевая лигаза Т4).

Компоненты реакционной смеси

60 мкл ДНК после репарации и подготовки концов;
25 мкл LNB;
10 мкл Salt-T4 DNA Ligase;
5 мкл LA.

Общий объём = 100 мкл

Этапы

  • Используйте чистую пробирку DNA LoBind с меткой «Ligation».

  • Перед добавлением LNB медленно перемешайте его с помощью дозатора. Этот буфер очень густой.

  • Добавьте 60 мкл подготовленной ДНК.

  • Добавьте 25 мкл LNB.

  • Добавьте 10 мкл Salt-T4 DNA Ligase.

  • Добавьте 5 мкл LA.

  • Аккуратно пропипетируйте 10-15 раз.

  • Не вортексируйте.

  • Выполните быстрое центрифугирование.

  • Выдержите 10 минут при комнатной температуре.

Перед выдерживанием вслух проговорите, все ли компоненты вы добавили:

DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase, LA.

Возможные ошибки:

Забыли добавить LA = библиотека не получится, образец окажется непригоден для секвенирования.
Забыли добавить Salt-T4 DNA Ligase = лигирование адаптеров не произойдёт. 
Плохо перемешали LNB = реакция лигирования пройдёт неэффективно.
Использовали вортекс = ненужное фрагментирование ДНК.

13. Очистка библиотеки после лигирования адаптеров

Цель: удалить свободные адаптеры, остатки лигазы, соли и мелкие фрагменты ДНК, сохранив при этом целевую ДНК с пришитыми адаптерами.

Важно: здесь при очистке используется LFB, а не этанол.

Исходные материалы:

100 мкл реакционной смеси после лигирования.

  • Вортексируйте флакон с магнитными шариками AMPure XP.

  • Добавьте 40 мкл взвеси AMPure XP к 100 мкл реакционной смеси.

  • Аккуратно пропипетируйте 10 раз.

  • Выдержите 5 минут при комнатной температуре.

  • Поместите пробирку на магнит.

  • Дождитесь полного осветления раствора.

  • Не снимайте пробирку с магнита.

  • Аккуратно удалите и слейте супернатант.

  • Следите за тем, чтобы не задеть осадок шариков.

Промывка 1

  • Добавьте 250 мкл LFB к шарикам.

  • Снимите пробирку с магнита.

  • Аккуратно ресуспендируйте шарики постукиванием по пробирке или медленным пипетированием.

  • Поставьте пробирку обратно на магнит.

  • Подождите, пока раствор станет прозрачным.

  • Удалите и слейте LFB.

Промывка 2

  • Добавьте очередные 250 мкл LFB.

  • Снимите пробирку с магнита.

  • Аккуратно ресуспендируйте шарики.

  • Верните пробирку на магнит.

  • Дождитесь осветления раствора.

  • Удалите и слейте LFB.

  • Удалите остаток LFB с помощью дозатора P10 или P20.

  • Не пересушите.

Элюция

  • Добавьте 25 мкл буферного раствора EB.

  • Снимите пробирку с магнита.

  • Аккуратно ресуспендируйте шарики.

  • Выдержите раствор 10 минут при комнатной температуре.

  • Верните пробирку на магнит.

  • Дождитесь осветления элюата.

  • Перенесите чистый элюат в чистую пробирку DNA LoBind с меткой «Final library».

Это ваша готовая библиотека для секвенирования.

Общее правило:

Жидкость убираем. Шарики оставляем.
В готовую библиотеку шарики не переносим.

14. Повторная проверка количества ДНК

Цель: измерить итоговую концентрацию ДНК в готовой библиотеке.

Поскольку при запуске с малым количеством исходного материала на выходе получается крайне низкая концентрация, прибор может показать очень малые значения или выдать ошибку.

Компоненты:

199 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS;
1 мкл раствора готовой библиотеки.

На экране Qubit укажите:

Sample volume = 1 µL

Запишите результаты:

Концентрация ДНК в готовой библиотеке:
Объём готовой библиотеки:
Расчётная масса загружаемой ДНК:

Рассчитайте:

Загружаемая масса (нг) = концентрация готовой библиотеки (нг/мкл) × 12 мкл

Если концентрация готовой библиотеки оказалась слишком низкой, не тратьте остатки образца на повторные измерения на Qubit, переводя драгоценные реактивы. Для тренировочного прогона просто добавьте 12 мкл библиотеки в загрузочную смесь.

15. Проверка проточной ячейки в программе MinKNOW

Цель: проверить работоспособность проточной ячейки перед загрузкой библиотеки.

  • Достаньте проточную ячейку из холодильника.

  • Оставьте её при комнатной температуре 20 минут.

  • Держите её строго в горизонтальном положении.

  • Не встряхивайте.

  • Подключите секвенатор MinION к компьютеру.

  • Запустите MinKNOW.

  • Вставьте проточную ячейку в секвенатор.

  • Запустите проверку (Run flow cell check).

  • Запишите количество активных пор (Active pores).

Таблица оценки качества ячейки:

>1200 пор = отлично.
800—1200 пор = пригодно.
500—800 пор = посредственно, подходит для тренировочных запусков.
<500 пор = плохо, но ещё сгодится для отработки механики процесса.
<200 пор = подходит только для тренировки самой загрузки.

Запишите результаты:

Идентификатор ячейки (Flow cell ID):
Начальное количество активных пор (Starting active pores):
Срок хранения ячейки (Flow cell age):
Использовалась ранее? (Previously used, да/нет):
Промывалась после использования? (Washed, да/нет):

16. Разбираемся с итоговыми пробирками и портами

В конечном итоге у вас получится три пробирки:

Пробирка 1: Final library (итоговая библиотека)
- Ваша готовая библиотека ДНК после очистки и пришивания адаптеров.

Пробирка 2: Priming mix (смесь для прайминга)
- Раствор для подготовки проточной ячейки к работе.

Пробирка 3: Loading mix (загрузочная смесь)
- Смесь, содержащая итоговую библиотеку, буфер для секвенирования и магнитные шарики.

На самой проточной ячейке есть два порта:

Порт 1: Priming port (порт для прайминга)
- Находится под пластиковой задвижкой. В него заливается смесь для прайминга.

Порт 2: SpotON sample port (для внесения образца)
- Небольшое углубление для ввода образца. В него по каплям вносится загрузочная смесь.

Важно: готовая библиотека не помещается напрямую в саму проточную ячейку. Сначала мы переносим её в пробирку с загрузочной смесью.

17. Приготовление смеси для прайминга проточной ячейки

Если в наличии есть БСА (BSA):

1170 мкл FCF;
5 мкл BSA (бычий сывороточный альбумин);
30 мкл FCT.

Общий объём = 1205 мкл.

Если BSA нет, и это тренировочный запуск:

1170 мкл FCF;
30 мкл FCT.

Общий объём = 1200 мкл.

Важно: нельзя заменять BSA на SFB, DCS, LIS или LNB.

Смешивайте всё осторожно, не допускайте образования пузырьков воздуха.

Это будет Пробирка №2: Priming mix.

18. Первый прайминг

Выполняйте только после проверки проточной ячейки. Предварительно посмотрите видео ниже. В нём наглядно показано, как правильно вносить растворы в ячейку.

  • Не отключайте проточную ячейку от прибора и держите её в строго горизонтальном положении.

  • Откройте задвижку порта для прайминга.

  • Проверьте, нет ли рядом с портом пузырьков воздуха.

Для удаления остатков воздуха подтяните обратно 20-30 мкл раствора:

Установите на пипетке P1000 значение 200 мкл.
Опустите её кончик в порт для прайминга.
Медленно прокрутите колёсико изменения объёма вверх до отметки 220-230 мкл.
Остановитесь, как только в кончик начнёт поступать жидкость.
Дальше не вытягивайте.

Теперь медленно введите в порт:

800 мкл смеси для прайминга

Избегайте появления пузырьков.

Подождите 5 минут.

19. Приготовление загрузочной смеси во время 5-минутного ожидания

Пробирка №3: Loading mix

Потребуется:

37,5 мкл SB;
25,5 мкл LIB;
12 мкл готовой библиотеки.

Общий объём = 75 мкл.

Важно:

LIB — это Library Beads из набора ONT. Не перепутайте их с магнитными шариками AMPure XP.

LIB быстро оседают. Перемешивайте их перед набором в дозатор.

Порядок действий:

  • Перемешайте флакон с LIB непосредственно перед пипетированием.

  • Добавьте 37,5 мкл SB в чистую пробирку.

  • Добавьте 25,5 мкл LIB.

  • Добавьте 12 мкл готовой библиотеки.

  • Аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.

  • Не вортексируйте пробирку.

20. Второй прайминг

После 5-минутного ожидания введите в порт для прайминга:

200 мкл смеси для прайминга.

Не допускайте образования пузырьков воздуха.

21. Загрузка библиотеки в порт SpotON

  • Непосредственно перед загрузкой аккуратно перемешайте содержимое пробирки №3.

  • Откройте порт SpotON.

  • Внесите все 75 мкл загрузочной смеси в порт.

  • Добавляйте их по одной капле.

  • Каждый раз обязательно дожидайтесь, пока предыдущая капля полностью уйдёт.

  • Не спешите.

  • Не тыкайте кончиком дозатора в порт.

  • Избегайте образования пузырьков.

Затем:

Закройте крышку SpotON.
Закройте порт для прайминга.
Установите светозащитный экран.
Закройте крышку секвенатора MinION.
Запустите секвенирование в MinKNOW (Start run).

Общая памятка:

Смесь для прайминга → вводится в порт для прайминга под сдвижной крышкой.
Загрузочная смесь → капается в открытый порт для образца SpotON.
Готовая библиотека → никогда не капается в сам прибор, а предварительно смешивается 
с загрузочной смесью.

22. Секвенирование ДНК с помощью MinKNOW

Рекомендуемые базовые настройки:

Flow cell type (тип проточной ячейки): FLO-MIN114
Kit (набор реагентов): SQK-LSK114
Basecalling (бейсколлинг): ON
Model: High-accuracy / HAC
Barcoding (баркодирование): OFF
Alignment (Выравнивание): OFF
Adaptive sampling (адаптивное секвенирование): OFF
Raw reads / POD5 (Сырые данные): ON
Filtering (фильтрация): OFF при выполнении тренировочных запусков с низкой концентрацией ДНК.

После этого:

Save configuration
Start

Для тренировочных запусков включайте POD5, чтобы данные можно было проанализировать позднее, даже если текущие данные в реальном времени окажутся слабыми.

23. Запуск бейсколлингка после завершения анализа (при необходимости)

  • Найдите каталог, куда сохранились сырые файлы POD5.

  • Установите Dorado.

  • Запустите бейсколлинг:

dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam

  • При необходимости конвертируйте полученный BAM-файл в формат FASTQ:

samtools fastq calls.bam > reads.fastq

  • Если захотите ускорить первый прогон, используйте вместо SUP модель HAC:

dorado basecaller hac pod5_directory/ > calls.bam

24. Сопоставление полученных чтений с референсным геномом человека

  • Скачайте файл референсного генома GRCh38 в формате FASTA.

  • Проиндексируйте референс:

minimap2-d GRCh38.mmi GRCh38.fa

  • Сопоставьте полученные чтения с референсом:

minimap2-ax map-ont GRCh38.mmi reads.fastq | samtoolssort-o aligned.bam

  • Проиндексируйте BAM:

samtools index aligned.bam

  • Просмотрите итоговую статистику сопоставления:

samtools flagstat aligned.bam > flagstat.txt

  • Проверьте покрытие генома:

mosdepth sample_cov aligned.bam

25. Поиск вариантов

  • Установите ПО Clair3.

  • Используйте модель ONT.

  • Запустите Clair3, указав путь к референсному файлу GRCh38, упорядоченному BAM и каталогу для вывода результатов.

  • Убедитесь, что в выходных данных будет присутствовать файл VCF.

  • Не делайте глубоких выводов на основе вариантов, найденных в зонах с низким покрытием ДНК.

  • Относитесь к своему первому запуску MinION как к технической проверке, а не полноценной медицинской диагностике.

26. Аннотация вариантов

  • Установите ПО VEP.

  • Аннотируйте полученный VCF-файл относительно референса GRCh38.

  • Подключите БД ClinVar.

  • Подключите БД gnomAD.

  • Позже также можете подключить БД PharmGKB.

  • Сохраните итоговую таблицу со следующими столбцами:

    • chromosome — хромосома,

    • position — позиция в геноме,

    • ref — эталонный аллель,

    • alt — альтернативный аллель,

    • gene — название гена,

    • consequence — молекулярное следствие,

    • ClinVar significance — клиническая значимость,

    • gnomAD frequency — популяционная частота,

    • genotype — генотип,

    • read depth — глубина прочтения,

    • variant quality — качество определения варианта.

*Twitter (X) заблокирован на территории России решением Роскомнадзора в соответствии с требованиями законодательства

Комментарии (0)