Разработка терапии старения невозможна без достоверной диагностики старения. Не представляется разумным ожидание смерти человека или наступление смертельно опасного заболевания, чтобы понять: замедлили мы старение или нет, той или иной, терапией. Мы должны сразу видеть объективную картину, вызванными нашими интервенциями против старения.

В клинической практике пока не существует «большой диагностики старения». То есть, нет возможности у пациента и лечащего врача детектировать возрастные изменения на молекулярном уровне, предшествующие наступлению заболеваний. Мы хотим устранить этот пробел, прежде всего описав все основные маркеры возрастных изменения и доступный технологический уровень для их измерения.

Мы продолжим изложение концепции SENS-диагностики старения, исходя из того, что на сегодняшний день программа SENS (достижение пренебрежимого старения инженерными методами) наиболее полно описывает подходы по увеличению продолжительности жизни человека.

Многие слышали о гликозилировании белков, конечных продуктах гликирования (КПГ, AGE) и о вреде, который они наносят организму. Но, следует отметить, что присоединение сахаров к другим молекулам – это далеко не всегда патология. Само гликозилирование является очень распространённым и важным физиологичным процессом в живых организмах. Так, значительная часть всех белков, синтезируемых в клетках, подвергаются ферментативному гликозилированию, что необходимо для их нормального функционирования.

В основном в гликозилировании участвуют два гликана (углеводной части связки углевод-органическая молекула): N-гликаны (связанные с амидной группой аспарагина) и О-гликаны (связанные с гидроксильной группой серина или треонина). В связи со старением нас больше интересуют N-гликаны. Описано, что при старении меняется спектр сахарных цепочек, которые присоединяются к иммунным белкам при N-гликозилировании. И такое изменение играет одну из ключевых ролей в возрастном повышении общего воспаления в организме. Так, уровень гликозилированных антител IgG может предсказывать биологический возраст человека даже более точно, чем длина теломер [1].

Кроме этого, ещё два гликана, NGA2F и N2AF, показали себя перспективными биомаркерами старения. В рамках программы европейского исследования биомаркеров старения MARK–AGE, завершившейся в 2013 году, был разработан тест GlycoAgeTest, определяющий биологический возраст человека. В его основе – соотношение количества гликанов NGA2F (повышающихся с возрастом) и N2AF (уровень которых с возрастом понижается). Ещё одним потенциальным биомаркером старения и возраст-зависимых заболеваний (сердечно-сосудистых и диабета), описанным в рамках исследования MARK–AGE, стал гликопротеин кластерин, который участвует в стабилизации белковых структур [2].

Перейдём теперь к рассмотрению патологической части этого явления. Кроме регулируемого организмом ферментативного гликозилирования существует неферментативная форма этого процесса, т.н. реакция Майяра, результатом которой становится появление в организме разнообразных продуктов гликирования. Следует отметить, что процесс неферментатиивного гликозилирования практически не регулируется. Хотя есть возможность «сдерживания» гликозилирования через трансгликацию, при которой в «расход» идут глутатион, полиамины, тиолы, свободные аминокислоты, например, таурин, лизин. А также через инактивацию метилглиоксаля глиоксалазной системой: глиоксалаза I превращает метилглиоксаль и восстановленный глутатион в лактоилглутатион, который далее метаболизируется в D-лактат под действием глиоксалазы II.

Структура метилглиоксаля

Среди продуктов гликирования выделяют ранние (продукты Амадори) и поздние (или конечные) продукты гликирования. Неферментативное гликозилирование происходит в несколько этапов. Начинается этот процесс с того, что глюкоза и другие простые сахара соединяются с аминогруппой и запускают цепь дальнейших реакций. В начале в ходе реакции между альдегидной группой сахаров и аминогруппой образуется нестабильная альдиминовая группировка (основания Шиффа), которая может превращаться в ряд других, более стабильных соединений, ранних продуктов гликозилирования, т.н. продуктов Амадори. Одним из ранних продуктов присоединения глюкозы к белку является Nе–фруктозил–лизин, который, деградируя, в свою очередь, образует различные конечные продукты гликирования (КПГ). В наибольшем количестве в качестве КПГ образуются гидроимидазолоны, производные остатков аргинина, подвергшихся модификации глиоксалем, метилглиоксалем и 3–дезоксиглюкозоном (3–DG). Ещё одни хорошо изученные КПГ – N?–карбоксиметил–лизин (КМЛ) и N?–карбоксиэтил–лизин (КЭЛ), а также глюкозепан и пентозидин, характерные для перекрестных сшивок белков [3]. Одним из наиболее легко определяемых видов КПГ является пентозидин, который накапливается, например, в сухожилиях больших мышц человека (то есть там, где скорость оборота коллагена замедлена) начиная с 20 лет и его концентрация линейно увеличивается к старости.

До недавнего времени считалось, что глюкоза – это основное вещество для образования КПГ. Но точное установление различной скорости внутри- и внеклеточного образования КПГ показало, что это не так. Более высокой скоростью внутриклеточного образования КПГ обладают такие сахара, как фруктоза, глюкозо-6-фосфат и глицералальдегид-3-фосфат. Описано негативное воздействие глицеральдегида на молекулу основного сократительного и цитоскелетного белка актина, приводящее к образованию пентозидиновых и битирозиновых сшивок и потери функциональности актина [4].


Сшивание молекул коллагена глюкозепаном.

Как сегодня предполагается, неферментативное гликозилирование и КПГ тесно связаны с целым рядом возраст-зависимых заболеваний, таких, как диабет, ревматоидный артрит, атеросклероз, болезнь Паркинсона и Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, катаракта и онкологические болезни [5]. Белки, подвергшиеся гликированию в реакции Майяра, становятся афизиологично поперечно-сшитыми, теряя при этом свои свойства. Особенно большую проблему это представляет для долгоживущих белков (например, молекулы коллагена кожи, согласно ряду исследований, имеют период полужизни 15 лет, а хрящей — более 100 лет) которые составляют значительную часть всех белков в организме – около одной трети. Образовавшиеся дополнительные сшивки между молекулами нарушают функции этих белков, что приводит к потере эластичности тканей и часто наблюдается при старении и патологиях. Гликирование также становится причиной того, что и так медленно обновляемый белок коллаген становится еще более долгоживущим – после гликирования он приобретает резистентность к физиологическому действию эндогенных коллагеназ, которые обеспечивают обновление тканей.


На иллюстрации (а) показана схема коллагеновой фибриллы и образование глюкозепана, который ковалентно связывает боковые цепи лизина и аргинина. (б) Показана химическая структура глюкозопана, которая сшивает лизин (синий) с аргинином (красный). (с) Показана молекулярная модель глюкозопана.

Описано участие гликированного фактора роста фибробластов ?-FGF в образовании фиброзов. Гликирование последовательности арг-гли-асп белка фибронектина приводит к нарушению восстановительной способности сосудов и прогрессированию сосудистых патологий. КПГ накапливаются в линзе и сетчатке глаза с возрастом. Кристаллины, основные структурные белки хрусталика глаза, восприимчивы к гликированию и поперечному сшиванию. Гликирование белков хрусталика приводит к возникновению катаракты. Гликированный гемоглобин, который используют для определения среднего уровня гликемии за последние 3 месяца, теряет способность переносить кислород в ткани, что негативно сказывается на многих химических процессах.

Также известно, что гликирование белков и образование КПГ сопровождается увеличением свободнорадикальной активности и перекисного окисления липидов, что вносит свой вклад в развитие возрастных болезней. Связано это с тем, что в процессе гликирования белков запускаются процессы автоокисления сахаров, сопровождающиеся повышением продукции активных форм кислорода (АФК). Кроме этого, связывание КПГ с рецептором КПГ (RAGE) также приводит к образованию реактивных АФК и последующей активацией чувствительного к окислительному стрессу фактора транскрипции NF-kB, связанного с воспалением и атерогенезом.

В свою очередь, активация NF-?B увеличивает экспрессию RAGE, создавая цикл положительной обратной связи, который усиливает продуцирование промоторов воспаления. Кроме того, взаимодействие КПГ-RAGE активирует NADPH-оксидазу (комплекс ферментов, который продуцирует супероксид), что увеличивает внутриклеточный окислительный стресс. А увеличение окислительного стресса NADPH-оксидазой в ответ на взаимодействие AGE-RAGE активирует, в свою очередь, NF-?B. И здесь мы можем наблюдать целый ряд «порочных кругов» — циклов с положительной обратной связью.

Гликирование белков дыхательной цепи митохондрий тоже вносит свой вклад в этот процесс: нарушение в работе дыхательной цепи служит постоянным источником супероксидных радикалов. Кроме этого, формирование в митохондриях и в других структурах под воздействием гликирования неразлагаемых КПГ может быть ответственно за реализацию такого феномена, как «метаболическая память». Когда у больных диабетом 2 типа строгий контроль гликемии уже не предотвращает развитие осложнений, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Предполагается, что неразлагаемые КПГ играют в этом феномене основную роль [6].

Также при гликировании происходит увеличение воспалительных процессов. Так, при гликозилировании коллагена происходит накопление во внесосудистом матриксе конечных продуктов этого процесса, которые организм воспринимает как чужеродные. Из-за этого возникнет иммунный ответ, в ходе которого иммунные клетки – макрофаги – увеличат секрецию провоспалительных цитокинов (TNF-?, интерлейкина-6 и др.), которые известны своей способностью негативно влиять на резистентность к инсулину и атерогенез [7].

Кроме этого, «сшитые» белки меняют структуру (нанотопографию) и увеличивают жесткость внеклеточного матрикса и через механорецепторы мембраны и цитоскелет клеток совместно с сигнальными молекулами оказывают влияние на экспрессию генов, функцию клеток, тканей и организма в целом. Более того, благодаря пролину молекулы коллагена проводят слабые электромагнитные волны, генерируемые клетками и тканями, и, возможно, в дополнение к механическим и химическим сигналам, формируют единую биоэлектрическую сигнальную систему организма. Интересно отметить, что, меняя топографию среды или электромагнитное излучение, можно не только управлять клеточным циклом, но и превращать взрослые соматические клеток в стволовые без помощи вирусов с вектором факторов Яманака.

Даже незначительные изменения модуля сдвига и вязкоупругости межклеточной среды оказывают сильное влияние на клетки – «старый» внеклеточный матрикс может существенно ограничивать эффективность применения сенолитиков и терапии стволовыми клетками. Так, «молодые» фибробласты стремительно стареют в старом матриксе и наоборот – «старые» клетки утрачивают признаки связанного со старением секреторного фенотипа в «молодом» матриксе.

Какие есть причины возникновения гликированных белков и КПГ? Считается, что главная из них для современного человека сегодня – это нездоровая пища. Поджаренная коричнево-чёрная корочка на продуктах как раз и представляет собрание КПГ, образовавшихся из-за термической обработки продуктов (жарки мяса, картофеля и т.п.) при высоких температурах. Рекордсменом по количеству образованных КПГ считается поджаренный бекон. Кроме этого, потребление содержащих много быстрых углеводов продуктов (кондитерских изделий, сладких газированных напитков и пр.) также может способствовать гликированию белков и образованию КПГ. Известны продукты, которые, напротив, помогают противостоять накоплению КПГ – черная редька, редис, капуста брокколи, благодаря содержащемуся в них веществу сульфорафану. Как это не удивительно, но вместе с гурманами регулярно снабжают себя повышенными дозами КПГ и курильщики. Табачный дым содержит гликотоксины, которые реагируют с остатками лизина и аргинина, формируя КПГ. Вероятно, поэтому у курильщиков наблюдается хроническое воспаление дыхательных органов [8].

Как было уже сказано, кроме воздействия внешних факторов, образование КПГ в норме также происходит эндогенно (то есть внутри организма) в физиологических условиях. Хотя этот процесс медленный и незначительный, но существенно усиливается при повышенной концентрации свободных радикалов, при резистентности к инсулину, сахарном диабете и повышении уровня глюкозы в крови. Накапливаясь в организме, КПГ затягивают человека в «болото» патологических процессов, из которого потом не так просто выбраться.

По образному выражению авторов SENS, белковые сшивки действуют как молекулярные «наручники», связывающие молекулы белков, нарушая этим их функцию. Решением этой проблемы авторы SENS видят в разработке лекарств, которые смогут реагировать с поперечными сшивками и разрывать их, не разрушая других структурных особенностей молекул. По их мнению благоприятным обстоятельством в этом процессе является то, что сшивки, которые происходят как химические аварии в структурах наших белковых молекул, имеют очень необычное химическое строение, которое в норме не встречается в веществах, производимых организмом. Что должно облегчить поиск и создание терапевтических средств.

Кроме этого, авторы SENS определяют ещё ряд перспективных подходов для решения данной проблемы. Такие, как поиск или разработка ферментов, вместо лекарств, для разрушения сшивок. А также разработка «одноразовых» белков, которые разрушали бы сшивку, и потом сами были бы уничтожены в процессе. Известно, что такие белки существуют для других целей, например, регенерирующий ДНК белок MGMT [9]. В пользу подхода по поиску ферментов, говорит тот факт, что у живых организмов описаны дегликирующие ферменты. Так у грибов и бактерий найдены противостоящие гликированию ферменты амадориаза, фруктозолизин-6-киназа frlD и фруктозолизин-6-фосфат-дегликаза frlB, действующие на низкомолекулярные соединения аминокислот с сахарами [10]. У позвоночных обнаружены ферменты фруктозамин-3-киназа (FN3K) и родственный ей белок FN3K-RP, которые в состоянии расщеплять продукты гликирования внутриклеточно, в АТФ-зависимых процессах [11].

Считается, что глюкезепан, оказывает наибольшее влияние на течение болезней пожилого возраста человека и поэтому является приоритетной мишенью для противовозрастной терапии.

К сожалению, глюкозепан не был выбран целью для ранее разработанных препаратов против поперечных сшивок, таких как Alagebrium/ALT-711 (Wolffenbuttel et al., 1998), C36 (Cheng et al., 2007), vTRC4149 (Pathal et al., 2008), и ему только предстоит доказать свою роль в механизмах старения. Эти вещества были нацелены на нейтрализацию карбоксиметиллизина – самого распространённого позднего продукта реакции Майяра, накапливающемся в организме при диабете.

На данный момент группа Дэвида Шпигель из Йельского университета работает над синтезом антител против содержащих глюкозепан белков. Обри де Грей подтверждает важность исследований по глюкезепану и недавно сообщил о регистрации компании Revel, на базе которой, возможно, будут продолжены начатые в университете исследования.

Однако, есть вероятность, что ни антитела, ни энзимы, по причине своих размеров, не смогут проникнуть между фибриллами коллагена. Более того, разорванные поперечные сшивки коллагена восстанавливаются после окончания приема препарата, что будет требовать повторный курс терапии.

Поэтому искусственные энзимонтоподобные катализаторы, размеры которых может быть в несколько раз меньше размеров оригинальных энзимов – видятся более интересной альтернативой. Подобные молекулы с заданной каталитической активностью – спиролигомеры (spiroligomeres) разрабатывает группа Христиана Шафмейстер из Темпльского университета.

Как было замечено ранее, поскольку конечные продукты гликирования накапливаются во время старения, их количественное определение может быть точным и надежным биомаркером старения. Однако, как детектирование КПГ в организме, так и ранняя диагностика изменений состава и структуры межклеточного матрикса затруднены по причине ограниченного органами и системами характера изменений и необходимостью проведения множественной биопсии. Даже в одном организме результаты сильно отличаются в зависимости от места взятия биопсии и исследуемого вида конечных продуктов гликирования.

Доступные методы определения конечных продуктов гликирования в коже, такой как аутофлуоресценция, то есть без применения специальных красителей (прибор «AGE-READER», изготавливаемый голландской компанией DiagnOptics BV) не дают точных данных и на результаты измерений могут влиять многие факторы, например, изменения водно-солевого баланса организма.

Основным и наиболее точным методом количественной оценки КПГ в организме сегодня считается метод хроматографии в сочетании с масс–спектрометрической детекцией. Масс-спектрометрия позволяет идентифицировать белки с высокой степенью достоверности и определять их количества в сложных белковых смесях.

Также для определения уровня КПГ используется иммуноферментный анализ. Но этот метод имеет ряд качественных ограничений (недостаточная специфичность антител, влияние свободных продуктов гликирования и пр.). Поэтому считается, что целесообразно проводить его в сочетании с масс–спектрометрией. КПГ также можно идентифицировать по общей интенсивности их флуоресценции. Что тоже имеет свои ограничения (большинство КПГ количественно не флуоресцируют, поэтому не могут быть определены) и позволяет более точно определять низкомолекулярные пептиды КПГ и свободные продукты гликирования.

Одним из перспективных биомаркеров, показывающих не только накопление КПГ, но и увеличение риска смертности от всех причин, является плазменный карбоксиметил-лизин (КМЛ). КМЛ является одним из доминирующих КПГ в организме, как циркулирующих, так и тканевых. Кроме этого, КМЛ является единственным КПГ, который выступает лигандом для рецепторов КПГ (RAGEs). Связывание RAGE с КМЛ приводит к увеличению генерации свободных радикалов, активации пути ядерного фактора Nf-?B и повышению уровня медиаторов воспаления (таких, как фактор некроза опухоли-альфа, интерлейкин-6 и C-реактивный белок). Известно, что КМЛ накапливается в больших кровеносных сосудах с возрастом. И высокие концентрации этого КПГ в сыворотке связаны с большей артериальной жесткостью, мощным фактором риска развития сердечно-сосудистых патологий и смертности от них, что было показано в ходе Балтиморского продольного исследования старения [12].

Также известно, что пожилых людей с церебрально-сосудистыми заболеваниями повышенный уровень КМЛ обнаруживается в кортикальных нейронах и сосудах головного мозга, что связано с тяжестью когнитивных нарушений. В рамках 6-летнего исследования Invecchiare in Chianti, в котором приняли участие 1.013 человека старше 65 лет, было показано, что средняя концентрация КМЛ в плазме, которую измеряли иммуноферментным анализом, была значительно выше у тех людей, которые умерли от всех причин, чем у выживших [13]. В 2018 году группа датских и шведских учёных описала новое моноклональное антитело, D1-B2, нацеленное на КМЛ, которое имеет хороший потенциал при иммуноферментном анализе для обнаружения данного КПГ. [14]

Ранее при помощи метода связанной жидкостной хроматографии вместе с масс-спектрометрией были идентифицированы ряд КПГ (глюкозепан, DOGDIC, MODIC и GODIC), которые накапливаются в тканях при старении и патологиях и могут использоваться в качестве маркеров для патофизиологических процессов [15]. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяет детектировать ещё два класса КПГ, связанных со старением и диабетом – GOLD и MOLD [16].

Авторы обзора: Денис Одиноков, Алексей Ржешевский.