Поддержание идеальной стабильности на основе отрицательной обратной связи – базовый элемент электрических контуров; однако до сих пор оставалось загадкой, как это удаётся делать живым клеткам.

Небольшой Lego-робот Мустафы Хаммаша увлечён игрой в гляделки с книгой, которую держат в 30 см перед ним. Хаммаш сдвигает книгу вперёд, и робот сразу же начинает жужжать своими четырьмя колёсами, чтобы следовать за ней; он придвигает книгу поближе, и робот отскакивает назад, оставаясь на расстоянии в 30 см от книги. Хаммаш прижимает машину очёшником, наклоняет стол под углом, заменяет колёса на другие, на 30% больше – и каждый раз робот восстанавливает буферную зону в 30 см между книгой, и вновь начинает смотреть на неё.

Странная способность робота подстраивать своё местоположение даёт ему то, что биологи называют устойчивой идеальной адаптацией. «Когда движение заканчивается, никаких ошибок не наблюдается, — сказал Хаммаш, специалист по теории управления из шведского государственного технологического института в Цюрихе. — Это идеальная адаптация; она идеально поддерживает расстояние».

Будь это индустриальные управляющие системы, или живая природа, отрицательная обратная связь (ООС) – вездесущая стратегия, помогающая системам справляться с возмущениями. «Люди замечали наличие таких систем обратной связи в физиологии с тех пор, как начали изучать физиологию», — говорит Ноа Олсман, специалист по теории управления из Гарвардского университета. Гомеостаз, саморегуляция биологических систем, удерживает многие физиологические параметры, к примеру, температуру тела, давление и уровень глюкозы в крови, в чётких рамках – бежим ли мы марафон, ныряем ли с аквалангом или устраиваем себе непрерывный просмотр сериалов на весь день. И не зря: «Если бы жизнь не могла реагировать на изменения и обучаться, она бы долго не протянула», — сказал Олсман.


Робот демонстрирует устойчивую идеальную адаптацию, поддерживая неизменное расстояние до цели, движущегося буклета. Подобное поведение невозможно без отрицательной обратной связи, в которой участвует контроллер под названием «интегратор»

Но, несмотря на всю важность этой обратной связи для жизни, биологам было очень сложно объяснить, как именно клетки и более сложные организмы реализуют системы ОС с достаточно точным и быстрым откликом. И только за последние пару десятилетий учёные смогли вывести какие-то базовые принципы. Прошлым летом случился важный прорыв, когда Хаммаш продемонстрировал искусственную систему ОС, которую можно установить на клетки, чтобы помочь им идеально адаптироваться к возмущениям, так, как это делает робот. Эта работа снабжена математическим доказательством отсутствия более простого способа решения данной проблемы — и это показатель того, что природные системы ОС, вероятно, работают таким же образом.

Задолго до того, как биологи разобрались, как эти возможности реализованы в природе, инженеры научились создавать электронные схемы для систем управления, позволяющие удерживать самолёт на курсе, поддерживать стабильную работу нефтеперегонных систем и других автоматических процессов. Специалисты по теории управления называют это отслеживанием с фиксированной точкой и нулевой стационарной ошибкой [set-point tracking with zero steady-state error]. С математической точки зрения, ООС может исправлять ошибку тремя способами: пропорционально, сообразно абсолютному размеру ошибки; интегрально, по размеру накопленных ошибок за время работы; дифференциально, в соответствии с тем, как быстро или медленно меняется ошибка. Электронные пропорционально-интегрально-дифференцирующие (ПИД) регуляторы комбинируют все три подхода и широко используются в промышленных управляющих системах.

Из всех них именно интегральная ОС даёт устойчивую идеальную адаптацию; пропорциональная и дифференцирующая ОС помогают устранять возмущения, но не исправляют ошибки полностью. Доказательство этого является «старой теоремой в теории управления», сказал Джон Дойл, математик из Калифорнийского технологического института. Чтобы понять, как природа достигает устойчивой идеальной адаптации, нужно было, чтобы специалист по теории управления заметил связь с интегральной ОС.

ООС – прекрасный пример удивительного сходства между биологией и инженерным делом. В 1948 году математик Норберт Винер предложил изучать регуляторные системы животных и машин совместно, в области науки, которую он назвал кибернетикой, от греческого «кибернетес», «искусство управления» (kybern?tes — рулевой).

«У математики, инженерного дела (по крайней мере, у современного) и биологии есть общая черта – огромная скрытая сложность», — сказал Дойл. Возьмём, к примеру, сотовый телефон. Управлять им, вроде бы, легко, но под этим скрывается множество слоёв управляющих схем, построенных один на другом.

«Биология работает похожим образом, — сказал он. – Мы живём своей жизнью, пользуясь сложностью наших тел; и если мы не болеем, они работают автоматически и без участия сознания. Мы практически не замечаем этого».

Как интегрируют коровы

Инженер-электрик по образованию, Хаммаш впервые взял в руки учебник по эндокринологии в государственном университете Айовы осенью 1998. У его жены, только что родившей первенца, развился послеродовой тиреоидит, и ему хотелось узнать больше о её болезни. Текст книги «мог вполне принадлежать учебнику по теории управления, только без уравнений, — сказал он. – Этот гормон делает то, это взаимодействие увеличивает количество того, это закрывает петлю обратной связи – та же самая история на новый лад».


Мустафа Хаммаш, профессор по теории управления и системной биологии

Хаммаш заинтересовался этой темой и отправился на другой конец кампуса, в национальный центр заболеваний животных. Там он познакомился с физиологом Джесси Гоффом, который предложил Хаммашу изучить «молочную лихорадку», заболевание пожилых молочных коров, связанное с недостатком кальция из-за производства молока.

Ионы кальция контролируют работу многих функций тела, в частности, сокращение мышц и передачу нервного импульса. Поэтому одной из наиболее строго регулируемых физиологических переменных у млекопитающих является уровень кальция в крови, попадающий в промежуток от 8 до 10 миллиграмм на децилитр. Дойка истощает кальций коров, приводя к серьёзным нарушениям его уровня в крови, говорит Хаммаш. Но у здоровой коровы уровень кальция в крови всегда восстанавливается.

«Я, как специалист по системам управления, сразу же подумал: Там должен быть интегратор», — сказал он. Поэтому вопрос превратился в следующий: «Как интегрируют коровы?»

Если машина едет слишком быстро, или робот слишком близко подошёл к объекту, то водитель может снять ногу с педали газа, а робот может отодвинуться, напрямую уменьшая или обращая вспять то, что пошло не так. Но в биологии и химии вычитаний не бывает – концентрация белка или скорость реакции не могут стать отрицательными. Даже если клетка остановит производство белка, существующие молекулы никуда не денутся. Вместо этого всё приходится контролировать через положительное значение переменных – через эквивалент тормоза, противоположного газу по эффекту. Необходимы некоторые механизмы математического интегрирования, вычисляющие, как сильно нужно давить на тормоз, и как долго.

Чтобы ответить на этот вопрос, Хаммаш заручился поддержкой своего студента Ханы Эль-Самад, ныне руководящей своей исследовательской группой в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Они быстро отмели возможность того, что интегральный контроллер состоит из одной молекулы; их должно было быть, по меньшей мере, две. Когда эту пару молекул обнаружили в 2002 году, оказалось, что они хорошо известны физиологам: это паратиреоидный гормон и особая форма витамина D, кальцитриол (или 1,25-DHCC).

Когда кальций в крови падает, паращитовидная железа выдаёт больше паратиреоидного гормона, стимулирующего ионы кальция покидать скелет, и исправляет ошибку пропорционально. Увеличение уровня паратиреоидного гормона повышают производство в кишечнике кальцитриола, усиливающего поглощение кальция в тонкой кишке. Поскольку скорость выработки кальцитриола привязана к концентрации паратиреоидного гормона, механизм ОС имеет интегральную природу.

Хаммаш был не единственным учёным, сообразившим, что для достижения устойчивой идеальной адаптации природа использует интегральную ОС. В 2000 году Дойл математически показал, что эффективность направленных движений бактерий в поисках еды достигается за счёт интегральной ОС. Позднее Эль-Самад, Хаммаш и Дойл в результате совместной работы показали, что шоковая реакция бактерий на тепло – их производство защитных молекул-шаперонов при перегреве – является устойчивым по той же причине.

Установка интеграторов в клетки

Решив проблему с кальцием, в 2002 году Хаммаш и Эль-Самад переехали в Калифорнию. Хаммад не сталкивался с устойчивой идеальной адаптацией до тех пор, пока не перебрался в Цюрих в 2011 году, и не получил возможность основать лабораторию синтетической биологии. На этот раз его задачей было искусственным образом ввести контроллер в клетки. Однажды такие синтетические клеточные контроллеры смогут помочь пациентам восстановить контроль над регуляторными процессами, переставшими нормально работать – как, к примеру, выработка инсулина у диабетиков.

К этому времени синтетические биологи уже создают простейшие контуры ООС в клетках, способные пропорционально исправлять ошибки. Первый пример – рудиментарный контур в кишечной палочке – появился в 2000 году. После этого Эль-Самад сообщила о внедрении контура пропорциональной ОС с синтетическими белками, разработанными совместно с Вашингтонским университетом. Эта работа была важной, поскольку Эль-Самад показала, что сконструированные белки можно использовать модульно, как PnP-периферию компьютеров, к примеру, мыши или принтеры.

Хаммаш решил научиться программировать в клетках интегральную ОС. «У любого уважающего себя контроллера должен быть интегратор», — сказал он, особенно если он хочет быть устойчивым.

Однако интегральную ОС не так-то просто создать. «Нужно сделать всё максимально правильно», — сказал Дойл. Иначе контроллер дестабилизируется. Вместо того, чтобы постепенно приближаться к целевому показателю, нестабильный контроллер будет постоянно промахиваться и начнёт колебаться вокруг цели.


Хана Эль-Самад, профессор биохимии и биофизики

К Хаммашу присоединилась Габриэль Лилаччи, теоретик, в тот момент последний год работавшая над докторской, и Стефании Аоки, микробиолог-постдок. Троица переехала в здание BSA-1058 в Биопарк Розенталя в Базеле, и начала обустраивать новую лабораторию на первом этаже. Ни у кого из них не было опыта работы в области синтетической биологии.

Первой схемой, которую попробовали Аоки и Лилаччи, был простой контур с парой молекул-контроллеров: по сути, белок A, включающий ген для белка B, и белок B, отключающий ген для белка A.

Идея не сработала. Это был неприятный период для Аоки и Лилаччи. «Оно не работает так, как ты ожидаешь, — сказала Аоки. – Появляется чувство, что ты его не контролируешь».

Частично проблема состояла в том, что создать клетку очень трудно. Перенос хорошо известных концепций электрических и механических систем в область биологии – задача сложная, пояснил Олсман. «Как взять идеи, которые можно реализовать при помощи резисторов и конденсаторов, и реализовать их при помощи белков, РНК и ДНК?»

И даже когда их кишечная палочка, наконец, начала подавать признаки того, что может исправлять результаты возмущений, оказалось, что на самом деле это был артефакт эксперимента. «Наверно, это был один из худших дней в лаборатории», — сказала Лилаччи.

В то время исследователи этого не поняли, но их первый вариант был неверен в принципе. С математической точки зрения одноклеточные организмы очень сильно отличаются от больших существ типа коров: они подвержены статистическому «шуму». В отдельных клетках содержится относительно немного молекул, пояснил Хаммаш. Случайность, проистекающая из вероятности встречи, столкновения и реакции различных молекул внутри клетки, играет гораздо большую роль.

Активаторы и анти-активаторы

На восьмом этаже BSA-1058 двое теоретиков команды Хаммаша, Корентин Брайат и Анкит Гупта, в начале 2014 начали обсуждать новую идею. Они поняли, что для минимизации влияния шума у двух молекул контроллера должна быть особая связь: они должны соединяться друг с другом и нейтрализовывать биологическую активность друг друга. Каждый должен быть антитезой другому.

В работе Брайат, Гупта и Хаммаш описали новую схему. В этой петле ООС молекула активатора должна была стимулировать выработку нужного белка. Концентрация этого белка в свою очередь определяла скорость производства молекулы анти-активатора, изолировавшей активатор. Если что-либо возмущало систему, любая ошибка в уровне белка корректировалась бы соответствующим изменением в скорости производства анти-активатора. А что лучше всего, поскольку молекулы активатора и анти-активатора ищут и нейтрализуют друг друга, такая петля будет работать даже в зашумлённой клетке.

Гупта математически доказал, что такая схема даст стабильный интегратор для шумных клеточных систем. Однако всё это было чисто теоретическими измышлениями. Троица разработала её, не зная, как будут выглядеть противоположные молекулы активатора и анти-активатора – или даже что такие молекулы существуют. Отсутствие у них знаний по биологии стало проблемой, когда оценивавший статью независимый специалист запросил у них конкретный пример.

Хаммаш написал емейл другу, биологу Адаму Аркину из Калифорнийского университета в Беркли, и попросил помощи. Аркин быстро предложил белки сигма-фактор и анти-сигма-фактор, в изобилии имеющиеся у бактерий. Аркин уже использовал их для создания в клетках искусственного выключателя.

При этом сигма и анти-сигма были не единственными возможностями. Были ещё смысловые и антисмысловые РНК, различные токсины и антитоксины. «Существуют горы химических реакций, подходящие для этой задачи», — сказал Олсман.


Члены лаборатории Хаммаша в Цюрихе

Теория была опубликована в январе 2016 года и вызвала большое воодушевление. «Теперь стало совершенно ясно, как реализовать эту интеграцию», — сказал Олсман. За два месяца до этого Хаммаш просил Аоки и Лилаччи отложить разработку, над которой они работали уже три года, и попробовать вместо неё создать этот контроллер. «Теоретическая основа для него была гораздо более прочной», — сказала Лилаччи. Они согласились попробовать, используя ту же пару сигма и анти-сигма факторов, что предложил им Аркин.

У них ничего не вышло – по крайней мере, поначалу. Аоки и Лилаччи пришлось что-то делать с двумя основными предположениями, которые в реальности не выполнялись. По одному получалось, что количество клеток не будет расти и разбавлять участвующие в процессе факторы. Однако они росли, и в случае с кишечной палочкой, количество клеток удваивалось каждые 30 минут. Согласно другому выходило, что скорость экспрессии белков можно подстраивать в любых пределах, а на самом деле ей существует предел.

Осенью 2017 года, пока его коллеги продолжали свои попытки в лаборатории, Гупта поехал на конференцию в Огайо. Там он встретился с другими исследователями, пытавшимися встраивать интеграторы в клетки по теории контроллера с антитезами. У всех были проблемы. Гупта решил, что может существовать другая, более простая в реализации схема, которая упростит жизнь экспериментаторов.

«Вполне разумно задавать вопросы о существовании более простых способов, — сказала Лилаччи. – И оказалось, что таких способов не было».

Гупта обнаружил, что математические ограничения для устойчивой идеальной адаптации были настолько серьёзными, что они ограничивали варианты схем, способных быть стабильными в шумных условиях. И всем им требовалась пара противоположных молекул.

Хаммаш и Гупта с ликованием восприняли математическое доказательство того, что их подход, пусть и трудный, был не просто надёжным, но неизбежным. Аоки и Лилаччи, которые уже видели первые признаки того, что их клетки могут начать приспосабливаться к возмущениям, эти новости только подстегнули.

«Узнать, что существует только одна базовая топология, способная достичь такого результата, было весьма удивительно для меня», — сказала Аоки.

Наконец, Аоки и Лилаччи вывели набор кишечных палочек, способных поддерживать стабильную флуоресценцию даже перед лицом возмущений в виде вводимого фермента, поедавшего белок зелёной флуоресценции. Ещё более интересная вещь произошла в другом наборе клеток, когда они занизили температуру инкубации с 37 до 30 градусов Цельсия, а скорость роста клеток не поменялась. Доказательство Гупты и эксперименты Аоки и Лилаччи были описаны в этом июне в журнале Nature.

Олсман надеется, что этот пример поспособствует проникновению более рациональных и математических подходов в область синтетической биологии, сделает её более инженерной. «Мы же не строим тысячу самолётов, чтобы поднять их в небо и надеяться, что они не упадут», — сказал он.

Кроме устойчивой идеальной адаптации существует ещё множество загадочных биологических явлений, требующих расшифровки – и Дойл надеется, что её удастся провести при помощи математики.