Как случайное открытие особенности биологии биолюминесцентной медузы привело к появлению одного из самых преобразующих инструментов в современной биологии — зелёного флуоресцентного белка

Летом 1961 года Осаму Симомура сидел в одиночестве в гребной лодке на берегу Пьюджет-Саунд в окружении тысяч светящихся медуз. Морской биолог и химик, он часто искал такие спокойные моменты, чтобы поразмыслить над своими экспериментальными неудачами. Две недели он пытался выделить светоизлучающую молекулу люциферина, которая, по мнению учёных, отвечает за свечение медуз. Там, на воде, его осенила новая идея: а что, если источником свечения является вовсе не люциферин?

Это озарение привело к открытию зелёного флуоресцентного белка, или ЗФБ [green fluorescent protein, gfp]. Хотя поначалу на ЗФБ не обращали внимания, впоследствии он произвёл революцию в биологии и медицине, за что и получил часть Нобелевской премии по химии 2008 года. Учёные поняли, что ЗФБ, белок с одним геном, функционирует как встроенный клеточный фонарик. Присоединив ген ЗФБ к другому интересующему их гену, они могли отслеживать перемещения белков, контролировать экспрессию генов и наблюдать за клеточными процессами в режиме реального времени.

 Медуза Aequorea victoria
Медуза Aequorea victoria

В 1999 году исследователи использовали ЗФБ для отслеживания распространения рака у живой мыши, наблюдая за ростом и метастазированием опухолей под флуоресцентным микроскопом. Годом позже две независимые команды внедрили ЗФБ в синтетические биологические схемы, что позволило им наблюдать, как живые клетки действуют как крошечные биохимические осцилляторы — начало синтетической биологии. Сегодня учёные часто визуализируют активность мозга с помощью модифицированных версий ЗФБ, измеряя, когда нейроны срабатывают.

Путь ЗФБ от малоизвестной сноски в научной работе до краеугольного камня науки был проделан в основном благодаря работе четырёх учёных. Первым был Осаму Симомура, который переехал из Японии военного времени в Принстон, штат Нью-Джерси, чтобы изучать биолюминесцентную медузу Aequorea victoria. Он неожиданно обнаружил в ней ЗФБ в виде побочного продукта своих исследований. Второй, Дуглас Прашер, биохимик из Вудс-Хоулского океанографического института в Массачусетсе, первым клонировал и секвенировал ген gfp в 1992 году. Мартин Чалфи, нейробиолог, первым осознал потенциал ЗФБ как генетического маркёра и продемонстрировал его использование в живых организмах. И, наконец, Роджер Тсьен, нейробиолог и химик, расширил возможности ЗФБ, создав целый спектр флуоресцентных белков, позволяющих отслеживать несколько генов и белков одновременно. Теперь эти флуоресцентные белки можно найти на столах и в морозильных камерах практически каждой биологической лаборатории.

 Разреженные гранулярные клетки, экспрессирующие ЗФБ.
Разреженные гранулярные клетки, экспрессирующие ЗФБ.

Осаму Симомура родился в 1928 году в Фукутияме, Япония. Его семья пять раз переезжала из-за армейской карьеры отца, прежде чем поселилась в Исахае, в 15 милях от Нагасаки. В 1944 году, в первый день его учёбы в десятом классе, военные мобилизовали его класс и направили Симомуру на местный военно-морской авиационный завод.

9 августа 1945 года Симомура стоял на вершине близлежащего холма и наблюдал за бомбардировщиком B-29, летевшим в сторону Нагасаки. Спустя несколько минут Симомура вернулся на своё рабочее место как раз в тот момент, когда интенсивная вспышка света залила завод и ослепила его на 30 секунд. Разрушения того дня повлияли на всю его дальнейшую жизнь, но два небольших поворота судьбы уберегли его от более серьёзных последствий.

Нагасаки в 1920-х годах. Исторически «Умэгасаки» (梅香崎) означало часть города, расположенную рядом с гаванью.
Нагасаки в 1920-х годах. Исторически «Умэгасаки» (梅香崎) означало часть города, расположенную рядом с гаванью.

Если бы он остался на холме и продолжал наблюдать за тем, как второй B-29 сбрасывает атомную бомбу, он мог бы получить необратимое повреждение глаз. А если бы его бабушка не настояла на том, чтобы он искупался после того, как вернулся домой, весь в чёрном пепле, он мог бы получить тяжёлое радиационное поражение. Позже Симомура вспоминал, что такие моменты удачи преследовали его на протяжении всей карьеры.

После войны Симомура изо всех сил пытался продолжить образование. Средние школы отвергали его из-за низких оценок, и он провёл два года без ясных перспектив. В конце концов, он поступил в фармацевтический колледж Нагасаки, который перевели в Исахая после того, как атомная бомбардировка разрушила его изначальное здание. Симомура проводил бесчисленные часы, изучая ионы металлов и совершенствуя свои навыки в колоночной хроматографии.

После окончания учёбы Симомура остался в аптечном колледже Нагасаки в качестве ассистента преподавателя, а затем перешёл в Университет Нагои в качестве научного сотрудника под руководством Йошимасы Хираты. Его задачей было очистить, кристаллизовать, а затем решить структуру люциферина Cypridina, светоизлучающей молекулы из морского светлячка, крошечного ракообразного (размером с кунжутное семя), распространённого на побережье Японии. Поскольку проект был сопряжён с высоким риском неудачи, его сочли неподходящим для студентов, желающих получить степень. Поскольку Симомура в то время не получал степени, эксперименты достались ему.

Этот проект познакомил его с биолюминесценцией. Учёные знали, что свечение морского светлячка появляется в результате химической реакции между люциферином и ферментом под названием люцифераза. Но после двух десятилетий усилий никто не смог успешно кристаллизовать люциферин — важнейший шаг к определению его структуры. Симомура потратил месяцы на выделение и очистку соединения, но каждая попытка кристаллизации заканчивалась неудачей.

 Биолюминесценция Cypridina.
Биолюминесценция Cypridina.
 Кристаллы люциферина из Cypridina.
Кристаллы люциферина из Cypridina.

Однажды холодным февральским вечером, после очередной неудачной попытки, Симомура выключил отопление в лаборатории и ушёл домой. Вернувшись на следующее утро, он обнаружил, что тёмно-красная жидкость, которую он оставил, стала бесцветной и содержала кристаллический осадок. Под микроскопом этот осадок превратился в тёмно-красные игольчатые кристаллы — долгожданный люциферин. Ночное понижение температуры вызвало кристаллизацию. Этот прорыв после десяти месяцев усилий стал первым крупным научным успехом Симомуры.

Вскоре последовали и другие хорошие новости. Во-первых, Хирата был настолько впечатлён своим молодым студентом, что в 1960 году присвоил ему степень PhD в области органической химии. Затем статья Симомуры о морских светлячках привлекла внимание Фрэнка Джонсона, профессора биологии Принстонского университета, который пригласил Симомуру учиться у него в Нью-Джерси. Симомура принял предложение и в августе 1960 года отправился в США в качестве стипендиата программы Фулбрайта.

По приезде в Принстон, Симомура получил от Джонсона пузырёк с сублимированными световыми органами медузы и предложение изучить их биолюминесцентные свойства. В то время преобладала гипотеза, что медузы Aequorea производят свет благодаря люциферину — маленькой молекуле, чувствительной к кислороду и влаге. Джонсон хотел, чтобы Симомура очистил, кристаллизовал и определил его свойства, как он это сделал с люциферином Cypridina. Симомура согласился.

Следующим летом Симомура отправился в Пятницу Харбор, штат Вашингтон, чтобы начать сбор медуз.

850 000 медуз

Медузы Aequorea кажутся почти прозрачными, у них видны только бледные линии, расходящиеся наружу, как рёбра зонтика. Каждая медуза достигает 8 см в поперечнике и весит около 50 граммов. При прикосновении они излучают зелёное свечение вдоль внешнего кольца, где находятся органы освещения. Aequorea процветала в Пьюджет-Саунд в середине XX века, особенно в районах вокруг острова Сан-Хуан, где находится Фрайдей Харбор.

 Медуза Aequorea victoria
Медуза Aequorea victoria

Симомура и его жена, а также Джонсон и научный сотрудник использовали сачки для вылавливания медуз из гавани. Каждое утро и вечер они собирали сотни экземпляров в большие вёдра. Во второй половине дня они отрезали полоски толщиной 2-3 миллиметра от внешнего кольца медузы и отжимали их через марлю, чтобы извлечь люминесцирующее вещество.

Биолюминесценция — это способность живых существ излучать собственный свет посредством точно подогнанных химических реакций. Например, у Cypridina люциферин реагирует с кислородом в присутствии люциферазы и излучает синий свет. У Aequorea привычное зелёное свечение возникает в результате сочетания биолюминесценции и флуоресценции — процесса, при котором свет с меньшей длиной волны (синий) поглощается и переизлучается в виде света с большей длиной волны (зелёный). В 1961 году Симомура сосредоточился исключительно на биолюминесценции, совершенно не подозревая, что в свечении медузы задействован дополнительный уникальный механизм флуоресценции.

В течение нескольких недель он безуспешно пытался извлечь люциферин из световых органов медуз. Он начал совершать одиночные прогулки на лодке по Пьюджет-Саунд, размышляя о провале гипотезы люциферин-люцифераза. Затем ему пришла в голову идея: «Даже если люциферин и люцифераза не участвуют в биолюминесценции медуз, — писал Симомура в своей автобиографии „Светящаяся погоня“, — вероятно, в реакции биолюминесценции участвует какой-то белок. Если это так, то активность этого белка, скорее всего, можно изменить или как-то повлиять на него через изменение pH».

Симомура начал проверять, как кислотность влияет на свечение медуз, замачивая их в буферных растворах с разным уровнем pH. Он обнаружил, что биолюминесцентный материал светится при pH 5, 6 и 7, но не при pH 4. Очевидно, очень кислые условия могут остановить биолюминесцентную реакцию. А поскольку экворин разрушается, как только начинает излучать свет, Симомура понял, что ему нужен способ сохранить его в целости и сохранности до того, как он «израсходует себя». Купание колец медузы в кислотном буфере остановило реакцию и сохранило экворин для дальнейшего изучения.

 Университет Вашингтона, лаборатория Фрайдей Харбор, 1961 год
Университет Вашингтона, лаборатория Фрайдей Харбор, 1961 год

Выбросив люминесцирующее вещество в раковину, Симомура с удивлением увидел, что оно светится ярко-синим цветом. Он знал, что в раковину стекает вода из аквариума с солёной водой, и сразу же заподозрил, что реакцию вызвало что-то, содержащееся в морской воде. Поскольку других правдоподобных причин не было, он предположил, что неожиданное свечение вызвали ионы кальция, содержащиеся в солёной воде. Чтобы подтвердить это, он добавил кальций в люминесцентный экстракт в контролируемых условиях и снова увидел ту же яркую вспышку света. Эта находка доказала, что биолюминесценция Aequorea зависит от кальция. Симомура назвал светопродуцирующий белок «экворин» [aequorin].

С этим новым пониманием команда отправилась собирать как можно больше медуз до окончания сезона. Собрать их было довольно просто, но вырезать трехмиллиметровые кольца из скользких животных оказалось утомительным занятием. К концу первого лета они извлекли материал примерно из 10 000 медуз и отвезли его в Принстон для дальнейшего изучения.

Вернувшись в Нью-Джерси, Симомура обнаружил второй белок зелёного цвета в дополнение к экворину, когда проводил эксперименты с колоночной хроматографией, чтобы выделить каждый биохимический компонент. Он назвал его «зелёным белком» и связал с естественным зелёным свечением медузы. Его переименовали в «зелёный флуоресцентный белок», когда учёные поняли, что цвет обусловлен флуоресценцией. В статье 1962 года Симомура подробно описал своё открытие экворина, но о «зелёном белке» упомянул лишь в сноске.

Свечение экворина в присутствии кальция быстро начали использовать в биологических исследованиях. В 1960-х годах многие учёные подозревали, что ионы кальция играют важную роль в жизни живых организмов, но им не хватало точных доказательств. В 1967 году учёные из Орегонского университета использовали экворин, чтобы доказать, что ионы кальция связывают срабатывание нервных клеток с мышечными сокращениями.

 Молекулярная структура экворина (слева) и зелёного флуоресцентного белка (справа). Экорин светится только при наличии коэлентеразина, молекулы кофактора.
Молекулярная структура экворина (слева) и зелёного флуоресцентного белка (справа). Экорин светится только при наличии коэлентеразина, молекулы кофактора.

По мере того как полезность экворина росла, Симомура чувствовал себя всё более обязанным понять механизм его биолюминесценции. После отъезда на несколько лет в Японию для изучения других биолюминесцентных видов, он возобновил работу над медузами в лаборатории Джонсона в 1967 году.

Определение структуры и механизма действия экворина потребовало гигантских усилий. Для сбора достаточного количества экворина для одного структурного исследования требовалось около 50 000 медуз, а группа должна была провести множество исследований в течение нескольких сезонов. Однако изобретательность Джонсона в создании машины для разделки медуз помогла команде обрабатывать до 6 000 медуз в день. Джонсон создал устройство из использованных ножей для нарезки мяса, соединённых с мотором. Прижимая медузу к медленно вращающемуся диску с шипами — медузной «вилке», — он быстро отделял тонкие полоски от внешнего кольца каждого животного.

 «Медузорезка» повысила производительность команды с сотен медуз до тысяч в день
«Медузорезка» повысила производительность команды с сотен медуз до тысяч в день

Изначально Симомура сосредоточился на экворине, но благодаря этой работе он заложил основу для гораздо большего успеха ЗФБ. Поскольку световые органы Aequorea всегда содержат и экворин, и ЗФБ, Симомура неизбежно собирал ЗФБ вместе с ними. После пяти лет сбора медуз он определил структуру светоизлучающего компонента экворина и опубликовал свои результаты в 1972 году. Однако потребовалось ещё несколько лет, чтобы полностью раскрыть механизм, с помощью которого экворин связывается с ионами кальция и производит синий свет.

В 1974 году Симомура продемонстрировал, что ЗФБ поглощает синий свет экворина, а затем переизлучает его в виде зелёного, таким образом, определив механизм флуоресценции и зелёное свечение медузы. К 1979 году он собрал достаточно очищенного ЗФБ, чтобы проанализировать аминокислотную последовательность и собрать воедино его структуру, которая оказалась весьма необычной. В то время как большинству флуоресцентных белков для работы требуется внешняя флуоресцентная молекула — хромофор, хромофор ЗФБ формируется внутри собственной аминокислотной цепи. Такая автономная флуоресценция делает ЗФБ стабильным и более подходящим для клонирования, поскольку его можно создать из одного гена.

Какое-то время ЗФБ оставался нишевым белком. Он нёс в себе интригующий хромофор, но в остальном не имел непосредственного практического применения. Синтетические флуоресцентные красители, такие как флуоресцеин, обеспечивали сходные характеристики поглощения и эмиссии и их было просто синтезировать химически; не нужно было резать десятки тысяч медуз.

Лето во Фрайдей Харбор стало ежегодной традицией для семьи Симомура. В течение двух десятилетий он использовал медуз для собственных исследований, а также поставлял экворин коллегам. Это было ещё до того, как с помощью клонов ДНК можно было синтетически получать эти белки, и немногие исследователи были готовы выдержать изнурительную работу по сбору и разделке медуз. За 19 поездок во Фрайдей Харбор семья Симомура собрала более 850 000 медуз.

 Собиратели медуз, городские доки Фрайдей Харбор, 1974 год
Собиратели медуз, городские доки Фрайдей Харбор, 1974 год

Хотя Симомура и его команда стали основным производителем ЗФБ, это не было его истинной страстью. В конце концов он вернулся к более широкому спектру вопросов из фундаментальной науки о биолюминесценции, и путешествовал по миру, чтобы изучать её у различных видов: светящихся червей в пещерах Новой Зеландии, светящегося криля в Швеции, огненных червей на Бермудах и красную медузу Periphylla во фьордах Норвегии. Позже он отметил, что все эти усилия поблёкли перед его ролью в широком распространении ЗФБ.

Симомура внёс свою лепту в развитие ЗФБ. Он описал его флуоресцентную природу и спектральные свойства, а затем определил его уникальную структуру с помощью самодостаточного хромофора. Но пришло время, когда факел подхватили другие учёные, нацеленные на его практическое применение.

 Пещеры светящихся червей в Новой Зеландии
Пещеры светящихся червей в Новой Зеландии
 Медуза-шлем (Periphylla periphylla) на большой глубине у побережья Хордаланда, Норвегия
Медуза-шлем (Periphylla periphylla) на большой глубине у побережья Хордаланда, Норвегия

Передача эстафеты

Дуглас Прашер был постдокторантом в Университете Джорджии в 1980-х годах, когда он начал изучать Aequorea. Как и Симомура, Прашер отправился во Фрайдей Харбор, чтобы собрать тысячи медуз и извлечь их световые органы. Но если Симомура не искал практического применения светящейся субстанции, то Прашер подозревал, что её можно с успехом использовать в биологии.

Если в любом живом организме экспрессировать один-единственный ген, чтобы получить этот флуоресцентный белок, рассуждал Прашер, то можно будет пометить практически любой интересующий ген или белок и проследить за его развитием внутри клетки.

Прашер решил найти ген ЗФБ, а затем клонировать его, создав библиотеку генов из тканей медузы Aequorea. Каждая клетка содержит матричную РНК (мРНК), которая несёт в себе инструкции по созданию белков, поэтому Прашер сначала извлёк мРНК из Aequorea и преобразовал её в комплементарную ДНК (кДНК). Эта кДНК, находящаяся в вирусе-бактериофаге, который легко реплицируется внутри бактерий, содержит копии многих генов медузы, в том числе и гена ЗФБ. Но Прашеру нужен был способ перебрать эти гены и выделить тот, который отвечает за ЗФБ.

К счастью, за несколько лет до этого Симомура и другие учёные выделили часть аминокислотной последовательности ЗФБ. Прашер использовал эти последовательности для создания коротких синтетических ДНК-зондов, которые, по его мнению, соответствовали виду соответствующей ДНК. Затем он ввёл эти зонды — радиоактивно меченные для удобства обнаружения — в бактерии, содержащие фрагменты кДНК медузы. Там, где зонд связывался с нужным фрагментом ДНК, сигнал указывал на колонию бактерий, обладающих геном ЗФБ. Восстановив ДНК из этих колоний, Прашер смог выделить настоящий ген ЗФБ и подтвердить его идентичность с помощью дальнейших тестов.

 Слева направо, по часовой стрелке: Осаму Симомура, Мартин Чалфи, Дуглас Прашер и Роджер Тсьен.
Слева направо, по часовой стрелке: Осаму Симомура, Мартин Чалфи, Дуглас Прашер и Роджер Тсьен.

Как только Прашер выделил бактерии с геном ЗФБ, он использовал технологию секвенирования, чтобы определить точную последовательность нуклеотидов. В то время большинство молекулярных биологов использовали для секвенирования ДНК метод Сэнгера (дидезокси) с терминацией цепи. В этом методе дидезоксинуклеотиды — химически модифицированные нуклеотиды, которые останавливают дальнейшее расширение ДНК – включают во вновь синтезированную нить. Полученные фрагменты разделялись по размеру на полиакриламидном геле и визуализировались (обычно с помощью радиоактивного мечения), что позволяло вычленить полную нуклеотидную последовательность по одному основанию за раз. Используя эту технологию, Прашер успешно секвенировал ген ЗФБ и открыл путь к использованию белка в других организмах.

К тому времени Прашер открыл собственную лабораторию в Вудс-Холе, штат Массачусетс, и попытался внедрить ген ЗФБ в различные организмы — важнейший шаг в доказательстве его полезности в качестве клеточного маркёра. Но это оказалось чрезвычайно сложной задачей: в то время учёные полагали, что для активации флуоресценции ЗФБ могут потребоваться дополнительные ферменты. Когда бактерии не светились, предполагалось, что нужны другие компоненты медузы. Даже Симомура сомневался в том, что ЗФБ сможет функционировать вне своей родной медузоидной среды.

К сожалению, биолюминесценция считалась эзотерической областью. Вскоре финансирование Прашера иссякло, и он почувствовал себя всё более изолированным молекулярным биологом, окружённым морскими биологами в Вудс-Холе. Однако он не успел отказался от ЗФБ — ему вовремя позвонили два человека: Мартин Чалфи и Роджер Тсьен. Оба учёных видели статью Прашера о клонировании ДНК ЗФБ и спросили, можно ли им получить образец. Желая убедиться в успехе ЗФБ, Прашер отправил по одному образцу каждому.

Мартин Чалфи, нейробиолог, изучающий сенсорные ощущения у круглого червя C. elegans, увлёкся ЗФБ как биологическим маркёром, узнав о нём на одном из семинаров. Когда он получил ДНК ЗФБ от Прашера, у него было два варианта: вырезать ДНК с помощью фермента, что дало бы дополнительную некодирующую ДНК медузы, или использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации только кодирующих областей — метод, который рисковал внести мутации.

Чалфи решил действовать методом ПЦР. Через месяц после получения ДНК от Прашера Чалфи удалось создать светящиеся бактерии, а вскоре после этого — светящихся круглых червей. Эта работа попала на обложку журнала Science в феврале 1994 года. В отличие от него, те, кто выбрал ферментный метод, не смогли получить светящиеся бактерии, вероятно, потому, что дополнительная ДНК медузы мешала им, что заставило некоторых утверждать, что для этого процесса необходимы дополнительные компоненты медузы.

 Статья Мартина Чалфи 1994 года, описывающая светящихся круглых червей, на обложке журнала Science.
Статья Мартина Чалфи 1994 года, описывающая светящихся круглых червей, на обложке журнала Science.

Однако синтетическая экспрессия «дикого» ЗФБ не всегда надёжно работала. Например, при введении в дрожжи флуоресценция получалась очень слабой и сильно варьировалась от клетки к клетке. Тсьен был полон решимости использовать свой обширный опыт в разработке флуоресцентных датчиков, чтобы преодолеть это и показать, что ЗФБ может стать революционным инструментом для визуализации биологических процессов.

Роджер Тсьен был заинтригован химией с самого раннего возраста. Он рос, модифицируя предметы домашнего обихода для проведения химических экспериментов на заднем дворе, а однажды даже пытался синтезировать аспирин. Он изучал нейробиологию в Гарварде, а затем поменял Кембридж (штат Массачусетс) на Кембридж (Великобритания), чтобы получить PhD. Хотя его интересовала нейробиология, он был недоволен традиционной электрофизиологией:

Мне это казалось слишком похожим на подлёдную рыбалку — прорубить дыру во льду, покрывающем озеро, опустить леску в непрозрачную воду и терпеливо ждать поклёвки. Мозг получает свою энергию от триллионов нейронов, работающих параллельно, поэтому я хотел увидеть множество нейронов, одновременно подающих друг другу сигналы и обрабатывающих информацию. В идеале нужно окрасить нейроны красителем, который бы заметно светился или менял цвет всякий раз, когда и где нейрон запускает потенциал действия.

Поэтому он начал разрабатывать более совершённые индикаторы активности нейронов, работая в аспирантуре и постдокторантуре. В то время существовало несколько коммерческих красителей, реагирующих на изменения мембранного потенциала, но их оптический отклик было трудно обнаружить. Тсьен решил работать с кальцием, поскольку потенциалы действия нейронов вызывают более значительное и медленное увеличение концентрации кальция, что облегчает их обнаружение.

Он был знаком с экворином как средством для определения наличия кальция в клетках. Однако, чтобы обнаружить внутриклеточную активность кальция, экворин нужно было кропотливо вводить в каждую клетку. Он также знал о ЗФБ, поскольку интересовался им, узнав, что Прашер клонировал его ДНК. Тсьен решил работать не с бактериями, а с дрожжами и начал модифицировать белок, чтобы улучшить его флуоресценцию.

Работа Тсьена привела к двум значительным достижениям. Во-первых, он улучшил флуоресценцию «дикого» ЗФБ, введя мутацию S65T. В своей естественной форме ЗФБ поглощает как ультрафиолетовый (395 нм), так и синий (475 нм) свет, что делает его флуоресценцию непостоянной и нецелесообразной для исследований. Тсьен определил, что серин 65 (S65) играет ключевую роль в этом двойном поглощении. Заменив его на треонин (S65T), он стабилизировал хромофор таким образом, чтобы устранить УФ-поглощение и сместить возбуждение на одно, более сильное поглощение при 488 нм. Это сделало ЗФБ более ярким, стабильным и идеальным для флуоресцентной микроскопии.

 Мутация аминокислоты серин в положении 65 в ЗФБ изменяет спектры возбуждения белка
Мутация аминокислоты серин в положении 65 в ЗФБ изменяет спектры возбуждения белка
 Четыре мутанта ЗФБ, экспрессированные в E. coli
Четыре мутанта ЗФБ, экспрессированные в E. coli

Во-вторых, исследования Тсьена были направлены в первую очередь на совместные флуктуации двух различных клеточных компонентов. Поэтому для одновременного отслеживания обоих компонентов потребовалось бы как минимум два флуоресцентных цвета. Имея богатый опыт создания синтетических красителей, Тсьен решил именно так и поступить: произвольно мутировав в гене ЗФБ, чтобы изменить химическую структуру ЗФБ дикого типа, он смог создать не один, а три цвета: синий, голубой и жёлтый флуоресцентные белки. Например, мутация, вводившая гистидин на позицию 66, создавала синий флуоресцентный белок.

Кроме того, в знаменательной статье 1999 года сообщалось об обнаружении хромофоров у небиолюминесцентных кораллов, что привело к выделению красного флуоресцентного белка под названием dsRed. Тсьен модифицировал dsRed, чтобы создать полный спектр флуоресцентных белков в видимом диапазоне. Поскольку длины волн зелёного и красного цветов спектрально проще различать, чем зелёный и синий, использование этих двух цветов для визуализации позволило повысить точность различения сигналов от двух источников. Сегодня двухцветная визуализация с использованием ЗФБ и RFP является стандартным методом в биологических исследованиях.

 Набор разноцветных флуоресцентных белков, разработанный группой Роджера Тсиена
Набор разноцветных флуоресцентных белков, разработанный группой Роджера Тсиена

Позволив исследователям «подсвечивать» живые клетки, ЗФБ сыграл незаменимую роль в нейронауках, исследованиях рака и даже в разработке вакцин. Например, в исследованиях инфекционных заболеваний и вакцин ЗФБ сыграл решающую роль в изучении того, как вирусы распространяются в организме хозяина. В исследовании 2015 года учёные использовали вирусы с ЗФБ-метками, чтобы выявить уникальные схемы передачи ВИЧ — важный шаг к разработке терапии для предотвращения его распространения. Или можно обратить внимание на роль ЗФБ в нейронауках, где учёные теперь могут фиксировать активность более миллиона нейронов одновременно, сделав из ЗФБ светящийся переключатель.

Когда-то ЗФБ просто освещал прохладные воды, окружавшие гребную лодку Симомуры, а теперь он помогает выявлять молекулярные движения в синапсах. ЗФБ и его разноцветные потомки кардинально изменили методы проведения биологических и физиологических исследований. Симомура, Прашер, Чалфи, Тсиен и многие другие учёные, участвующие в исследованиях ЗФБ, построили свои достижения на том, что медуза Aequorea victoria делала на протяжении более 150 миллионов лет.

Комментарии (0)