Одной из самых загадочных и сложных для полного понимания систем является мозг человека. Будучи центром управления всех других систем организма, местом хранения и обработки информации, мозг выполняет множество различных как по сложности, так и по направленности операций круглосуточно и без передышки. Попытки имитировать структуру мозга в виде искусственных биологических аналогов сопряжены с рядом проблем ввиду вышеописанной сложности структуры этого органа. Более успешными были попытки создать систему, которая имитирует лишь малую долю мозга. В таких ситуациях часто применяются органоиды, т. е. упрощенные миниатюрные версии органов. Ученым из Университета Джонса Хопкинса (Балтимор, США) удалось создать первый в мире органоид, имитирующий полный мозг на ранних этапах развития. Как именно ученым это удалось, что они узнали нового, и как подобная разработка может быть использована на практике. Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Неврологические заболевания – одна из самых серьезных проблем современного мира, поскольку они затрагивают более миллиарда человек во всем мире. Еще более серьезная проблема касается нарушений развития нервной системы. По примерным оценкам в 2019 году 317 миллионов детей во всем мире страдали от нарушений развития.

Современные платформы для создания мозговых ассемблоидов были усовершенствованы таким образом, что теперь можно создавать комбинации кортикальных органоидов, областей среднего и заднего мозга, что приближает их на шаг к построению модели развития человеческого мозга. Тем не менее остаются две основные проблемы:

• хотя исследователи и инкорпорировали изолированные эндотелиальные клетки с корковыми органоидами, инкорпорация эндотелиальной системы с несколькими областями мозга одновременно остается неизученной;

• в настоящее время вместо эндотелиальных органоидов используются изолированные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC от human umbilical vein endothelial cell), которые содержат множество типов клеток, включая сосудистые предшественники, зрелые эндотелиальные перициты, пролиферирующие ангиогенные и стромальные клетки, которые лучше отражают нативную нейроваскулярную среду.

Недавние исследования показали, что эндотелиоподобные клетки CD31⁺ могут возникать в церебральных органоидах с использованием инженерных платформ, таких как биореакторы и микрофлюидные системы, создающие низкое напряжение сдвига. Хотя эти подходы подчеркивают роль биомеханических сигналов в дифференциации сосудов, они по-прежнему ограничиваются моделями одной области и не включают многоклеточные эндотелиальные системы, репрезентативные для нейроваскулярной ниши in vivo.

В процессе внутриутробного развития человека эндотелиальная и нервная системы развиваются согласованно, поскольку эти две системы взаимосвязаны посредством нескольких петель обратной связи, которые контролируют региональное развитие. Важно учитывать эти взаимодействия для создания моделей нарушений нейроразвития в различных областях мозга. Однако предыдущие исследования, в которых рассматривались эндотелиальные клетки, основывались преимущественно на васкуляризации корковых органоидов, игнорируя роль эндотелиальных факторов в развитии других областей мозга.

Чтобы устранить эти фундаментальные пробелы, ученые разработали платформу «Мультирегиональные органоиды мозга» (MRBO от Multi-Region Brain Organoids), которая воспроизводит ключевые аспекты развития мозга плода человека, объединяя органоиды церебрального, среднего и эндотелиального отделов мозга в единую конструкцию. Данные показывают, что эти регионоспецифичные органоиды сохраняют уникальные транскрипционные профили, тесно коррелирующие с региональной идентичностью мозга плода человека.

Результаты исследования

Изображение №1

MRBO была создана с использованием трех линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC от induced pluripotent stem cell) здоровых доноров по систематическому протоколу, который объединяет церебральные, эндотелиальные и задне-/среднемозговые органоиды (1a, 1b). Органоиды головного мозга были получены по разработанным протоколам с использованием двойного ингибирования SMAD для нейрональной индукции с последующим созреванием в условиях 3D-культивирования для стимуляции развития корковых структур.

Эндотелиальные органоиды развивались параллельно из тех же линий iPSC. После формирования эмбриональных телец (EB от embryoid body) (дни 0–2) клетки направлялись в мезодермальную линию посредством активации WNT и стимуляции BMP4 (дни 2–9). Затем эти EB были помещены в матрикс коллагена I и фибронектина в соотношении 1:1, а последующее определение сосудистого направления достигалось добавлением VEGFA и FGF, начиная с 10-го дня.

SMAD — внутриклеточные белки-переносчики сигналов от рецепторов TGF-β в ядро, где они регулируют экспрессию генов.

WNT — семейство сигнальных белков, контролирующих рост, дифференцировку и развитие клеток.

BMP4 — костный морфогенетический белок 4, фактор роста из семейства TGF-β, регулирующий развитие мезодермы и формирование тканей.

VEGFA — сосудистый эндотелиальный фактор роста A, стимулирует образование новых кровеносных сосудов (ангиогенез).

FGF — фактор роста фибробластов, регулирует деление, миграцию и дифференцировку клеток в развитии и регенерации тканей.

Органоиды среднего/заднего мозга (MHO от mid/hindbrain organoid) были получены с использованием модифицированного протокола. В то время как первые пять дней следовали стандартной нейронной индукции, последующее формирование паттерна достигалось с помощью специфической комбинации морфогенов – CHIR, BMP4, IWR1 и SANT1. Эти органоиды были помещены в Матригель на 15-й день и содержались в среде для созревания, дополненной B27 и N2.

CHIR — малый молекулярный ингибитор GSK-3, который активирует путь WNT и стимулирует пролиферацию и дифференцировку клеток.

IWR1 — малый молекулярный ингибитор пути WNT, стабилизирующий белок Axin и тем самым блокирующий WNT-сигналинг.

SANT1 — ингибитор сигнального пути Hedgehog, действующий через блокаду рецептора Smoothened.

B27 — коммерческая добавка к клеточной среде, содержащая витамины, антиоксиданты, гормоны и другие факторы, необходимые для выживания и созревания нейронов.

N2 — питательная добавка к среде, содержащая трансферрин, инсулин, прогестерон и другие компоненты для поддержки роста нейрональных культур.

На 20-й день эти три различных типа органоидов были объединены, используя Матригель в качестве поддерживающей матрицы. Успешная интеграция была подтверждена с помощью световой микроскопии (видео ниже). Полученные MRBO сохранялись до 60-го дня, когда был проведен комплексный анализ. Эта единая структура обеспечивает надежную платформу для изучения межрегиональных взаимодействий в трехмерной микросреде мозга, позволяя исследовать сложные процессы нейроразвития и механизмы заболеваний.

*Видео №1*

Чтобы определить, включает ли MRBO все типы клеток, присутствующие в отдельных органоидах, образующих сборку, ученые провели анализ методом одноядерного секвенирования РНК. Полученная визуализация UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) выявила отдельные транскрипционные кластеры, отражающие полное клеточное разнообразие MRBO (1c). Благодаря детальной аннотации этих кластеров на основе канонических маркеров были идентифицированы множественные популяции нейронов наряду с типами эндотелиальных клеток, что подтвердило успешную интеграцию как нейронов, так и сосудов. Эта комплексная клеточная карта (1c) продемонстрировала, что MRBO сохраняют ключевые популяции клеток из составляющих их органоидов, формируя при этом единую структуру.

Чтобы лучше понять сигнатуры экспрессии генов, определяющие каждый кластер, был проведен анализ генной онтологии (GO от gene ontology) маркеров, специфичных для каждого кластера (1d). Клетки, представляющие продвинутые стадии дифференцировки, такие как нейроны и олигодендроциты, показали обогащение терминами GO, связанными с развитием нейронов, аксоногенезом, наведением аксонов и развитием переднего мозга. Напротив, клетки со стволовыми признаками, такие как ранние пролиферирующие прогениторы, радиальные глиальные клетки и прогениторы олигодендроцитов, были обогащены терминами, связанными с пролиферацией клеток и митотическими процессами.

Дополнительно было проведено исследование организации развития в пределах MRBO. Программный пакет для анализа одноядерного РНК-секвенирования TSCAN (Tools for Single-Cell ANalysis) был применен к данным секвенирования одноядерной РНК для определения псевдовремени и идентификации клеточных траекторий как в нейрональном, так и в эндотелиальном компонентах MRBO. Этот анализ пролил свет на пространственную и временную организацию органоида, выделив распределение типов клеток и стадии их дифференцировки (1e).

Псевдовремя (pseudotime) — вычисляемая последовательность состояний клеток, отражающая их прогресс в процессе дифференцировки или созревания, даже если экспериментально все клетки собраны в один момент времени.

Высокие значения псевдовремени наблюдались в высокодифференцированных клетках, таких как зрелые нейроны и олигодендроциты, в то время как низкие значения псевдовремени соответствовали клеткам со стволовыми свойствами и пролиферативной активностью. Интересно, что экспрессия генов, активируемых вдоль траектории псевдовремени, показала, что семейство факторов транскрипции HOX было высоко экспрессировано в клетках с высоким псевдовременем (1f), что указывает на развитие областей среднего и заднего мозга.

HOX — это семейство транскрипционных факторов, которые определяют сегментацию и позиционное развитие тканей вдоль переднезадней оси эмбриона.

Генный онтологический анализ наиболее часто экспрессируемых генов при низком псевдовремени подтвердил обогащение процессов, связанных с пролиферацией клеток и митозом, в то время как гены, экспрессирующиеся при высоком псевдовремени, были связаны с развитием нервной системы и морфогенезом (1g). Для эндотелиального компонента наблюдалась траектория созревания вдоль псевдовремени, характеризующаяся экспрессией генов, связанных с пролиферацией клеток, при низком псевдовремени и переходом к генам, связанным с синтезом эндотелиального внеклеточного матрикса, при высоком псевдовремени.

Ученые оценили эффективность интеграции и клеточный состав в различных комбинациях органоидов. Был проведен комплексный анализ, объеденяющий данные одноядерного секвенирования РНК всех типов органоидов – отдельных компонентов (кортикальных, эндотелиальных и органоидов среднего/заднего мозга) и их различных комбинаций (кортикально-эндотелиальных, эндотелиальных и органоидов среднего/заднего мозга), а также полного MRBO. Полученная интегрированная визуализация UMAP (1h) выявила глобальный транскрипционный ландшафт во всех конфигурациях органоидов, что позволило напрямую сравнивать клеточные популяции и их распределение. Этот унифицированный подход к анализу позволил оценить, как клеточная идентичность сохранялась или изменялась в различных комбинациях органоидов, а также получить представление об успешной интеграции региональных идентичностей в структуре MRBO.

Уменьшение размеров и кластеризация интегрированного объекта выявили равномерное распределение клеток, полученных из MRBO, по всем интегрированным наборам данных. Анализ вклада каждого органоида в отдельные кластеры показал, что MRBO внес вклад в 20 из 24 кластеров (1i), при этом вклад был равномерно распределен между эндотелиальными, церебральными и кластерами среднего/заднего мозга, что подчеркивает прочную интеграцию составляющих органоидов. Кроме того, была проанализирована корреляция экспрессии генов среди различных типов органоидов, показавшая, что MRBO демонстрирует сильную корреляцию с органоидами, полученными из нейронной линии (церебральными и среднего/заднего мозга). Это указывает на то, что они являются наиболее значимыми компонентами сборки, хотя эндотелиальный компонент также представлен.

Чтобы оценить биологическую значимость MRBO как продвинутой модели развития мозга, ученые интегрировали данные MRBO с данными одноядерного секвенирования РНК из мозга плода человека. Уменьшение размерности и кластеризация интегрированного набора данных показали существенное перекрытие между MRBO и мозгом плода человека (стадия Карнеги развития человека 12–16) (1k).

Стадии Карнеги человеческого развития — это система классификации стадий эмбрионального развития человека по морфологическим признакам, а не по хронологическому возрасту. Всего есть 23 стадии, охватывающие первые 8 недель развития эмбриона.

Клетки MRBO составили 80% от общего числа кластеров после интеграции с данными органоидов мозга плода (1k) и оказались ассемблеидом, наиболее тесно коррелирующим с паттернами экспрессии генов мозга плода (1l). Эти результаты подтверждают пригодность MRBO в качестве релевантной модели для изучения развития мозга и региональной спецификации.

Кроме того, ученые провели оценку воспроизводимости MRBO. GAD65, маркер ГАМК-ергических нейронов, продемонстрировал отличную воспроизводимость (82.09%) между линиями, в то время как CTIP2, маркер нейронов глубоких слоев, сохранял высокую стабильность (76.20%). Эндотелиальный маркер CD31 продемонстрировал большую вариабельность между линиями, но сохранял единообразие паттернов экспрессии внутри каждой линии. Средняя общая воспроизводимость 68.47% по всем маркерам демонстрирует надежность органоидной системы для моделирования развития нервной системы, особенно высокие результаты в отношении экспрессии нейрональных маркеров.

Изображение №2

Чтобы всесторонне охарактеризовать клеточную гетерогенность и подтвердить успешную интеграцию отдельных областей мозга, ученые провели сравнительный анализ одноядерного секвенирования РНК для всех типов органоидов – как отдельных компонентов (кортикальных органоидов, эндотелиальных органоидов и органоидов среднего/заднего мозга), так и их различных комбинаций (графики выше). Этот систематический подход к профилированию позволил проследить вклад каждого типа органоида в формирование конечной структуры, одновременно подтверждая сохранение клеточной идентичности, специфичной для отдельных областей.

Было выделено и проанализировано 4000–5000 отдельных ядер из двухмесячных органоидов каждого типа. Для создания комплексного представления клеточных популяций во всех образцах использовался комплексный вычислительный процесс. Интеграция данных после секвенирования проводилась с использованием конвейера Сёра, а снижение размерности достигалось с помощью метода аппроксимации и проецирования однородного многообразия (UMAP от Uniform Manifold Approximation and Projection). Этот комплексный подход к анализу позволил создать подробные карты транскрипции, которые показали, как отдельные популяции клеток из каждого компонента органоида поддерживались и объединялись в итоговой структуре MRBO.

Кластеризация на основе графов выявила отдельные клеточные популяции в MRBO и составляющих их органоидах. В MRBO было визуализировано девять отдельных кластеров. Анализ дифференциальной экспрессии выявил экспрессию ключевых генов, таких как VEGFA (маркер васкуляризации), CUX1 (маркер корковых нейронов) и HOXB3 (маркер заднего мозга), как показано в наложенных кластерах (2a). Эти результаты подтверждают наличие регион-специфических клеточных идентичностей в пределах MRBO. Также были проанализированы кластеры, специфичные для слияния. Эндотелиальные и MHO-слияние органоидов (эндо-MHO) выявили семь отдельных кластеров с дифференциально экспрессируемыми генами, включая VEGFA (маркер васкуляризации), TCF4 (маркер среднего мозга) и HOXB3 (маркер заднего мозга), которые были локализованы в определенных популяциях в пределах органоидов (2b). Аналогичным образом, шесть кластеров были идентифицированы в эндоцеребральных органоидах (2c), а еще шесть кластеров наблюдались в MHO (2d). Каждый кластер соответствовал уникальной клеточной идентичности, что указывает на успешную дифференцировку и функциональную специализацию. Дальнейший кластерный анализ эндотелиальных органоидов выявил одиннадцать отдельных кластеров, включающих различные типы клеток, такие как воспалительные клетки, популяции сигнальных клеток факторов роста, клетки, связанные с ангиогенезом, и зрелые эндотелиальные клетки (2e). Разнообразие типов клеток отражает сильную васкуляризацию и клеточную специализацию, достигнутые в эндотелиальных органоидах. Разделение кластеров оценивали с помощью анализа ширины силуэта, при этом все кластеры показывали четкое разделение, подтверждающее четкие границы и минимальное перекрытие между кластерами. Канонические гены-маркеры и высокодифференцированно экспрессируемые гены использовались для ручной аннотации каждого кластера с его соответствующей клеточной идентичностью, что дополнительно подтверждает специфичность и точность протоколов дифференцировки и слияния.

Изображение №3

Эндотелиальные клетки играют ключевую роль в развитии и морфогенезе центральной нервной системы. Ученые предположили, что эндотелиальные клетки играют ключевую роль в развитии заднего мозга, о чем свидетельствует наблюдаемое повышение экспрессии HOXB3, коррелирующее с повышенной экспрессией эндотелиальных клеток (2a, 2b). Подобное явление не наблюдалось с TCF4, маркером среднего мозга (2d). Кроме того, в предыдущих исследованиях было установлено, что гены HOX играют ключевую роль в формировании заднего мозга, что указывает на потенциальное регуляторное взаимодействие между эндотелиальными клетками и экспрессией генов HOX. Для проверки этой гипотезы ученые объединили и интегрировали данные, полученные на многорегиональных органоидах мозга (MRBO), эндотелиальных органоидах и органоидах среднего/заднего мозга, как по отдельности, так и в различных сочетаниях (3a, 3b).

Была проведена кластеризация на основе транскрипционных профилей и анализ вклада каждого типа органоида в полученные кластеры (3c). Этот анализ показал, что кластер 6 присутствовал исключительно в органоидах, содержащих эндотелиальные компоненты, тогда как он отсутствовал в органоидах, состоящих исключительно из ткани среднего/заднего мозга. Для подтверждения эндотелиальной идентичности кластера 6 была изучена экспрессия ключевых маркеров эндотелиальных клеток, включая FLT1, COL16A1, COL6A3, COL1A1, ANGPT1 и NRP2 (3d). Было обнаружено, что эти маркеры высоко экспрессируются в клетках кластера 6, что подтверждает их эндотелиальную природу.

Для оценки паракринного сигнального вклада этих эндотелиальных клеток был использован CellChat для определения путей межклеточной коммуникации между кластерами. Основное внимание уделялось сигнальным путям, связанным с развитием нервной системы и эндотелиальными клетками (3e). Анализ выявил четыре ключевых сигнальных пути развития: VEGF, BMP, PDGF и IGF (3e). Этот кластер демонстрировал уникальное сигнальное поведение, включая аутокринную передачу сигнала VEGF и изоляцию для продукции факторов BMP и IGF. Кроме того, он является основным известным реципиентом сигналов, исходящих из окружающих нервных тканей в ответ на VEGF.

В сигнальном пути VEGF кластер 6 демонстрировал аутокринную сигнализацию и получал сигналы VEGF от всех других кластеров. Примечательно, что это был единственный кластер, экспрессирующий рецепторы VEGF. Аналогичная тенденция наблюдалась в пути PDGF, где оба кластера 6 и 3 экспрессировали рецепторы, хотя сигнальный эффект в кластере 3 был менее выраженным. Эти результаты свидетельствуют о том, что клетки кластера 6 функционируют не только как эндотелиальные клетки, но и как клетки, поддерживающие васкуляризацию (3f). Напротив, для путей BMP и IGF кластер 6 был исключительным продуцентом этих цитокинов, в то время как другие кластеры экспрессировали исключительно рецепторы для этих факторов. Это открытие подчеркивает уникальную сигнальную роль кластера 6. Оно повторяет ранние нейроваскулярные взаимодействия и молекулярные сигнатуры развивающихся кровеносных сосудов.

Чтобы исследовать, как эндотелиальные клетки влияют на развитие заднего мозга, была изучена экспрессия маркеров, специфичных для заднего мозга. Пять кластеров (5, 7, 11, 13 и 14) были идентифицированы как экспрессирующие маркеры, ассоциированные с мозжечком (3g). Интересно, что кластеры 7, 13 и 14 присутствовали только в органоидах, содержащих как компоненты заднего мозга, так и эндотелиальные компоненты. Чтобы исследовать траектории развития этих кластеров, ассоциированных с задним мозгом, ученые изолировали клетки кластеров 5, 7, 11, 13 и 14 и провели анализ псевдовремени (3h). Это выявило прогрессию развития, начинающуюся с кластера 5 (самое низкое псевдовремя), за которым следовали кластеры 14, 7, 13 и, наконец, 11 (самое высокое псевдовремя).

Чтобы понять биологические последствия этой прогрессии псевдовремени, ученые провели анализ онтологии генов (GO) для 1000 самых популярных генов, экспрессирующихся в клетках с низким псевдовременем, и 1000 самых популярных генов, экспрессирующихся в клетках с высоким псевдовременем (3i). Клетки с низким псевдовременем были обогащены терминами GO, связанными с аксоногенезом и наведением аксонов, что указывает на дифференцированные нервные клетки. Напротив, клетки с высоким псевдовременем были связаны с терминами, связанными с пролиферацией клеток, что согласуется с идентичностью клеток-предшественников.

Интересно, что в то время как клетки-предшественники (высокое псевдовремя) и дифференцированные клетки (низкое псевдовремя) присутствовали во всех органоидах, содержащих компоненты среднего/заднего мозга, промежуточные прогениторы (кластеры 7, 13 и 14) были обнаружены только в органоидах с эндотелиальными компонентами. Это открытие предполагает, что паракринная сигнализация от эндотелиальных клеток необходима для поддержания и пролиферации промежуточных прогениторных клеток во время развития заднего мозга. Кроме того, анализ CellChat выявил тринадцать различных сигнальных сетей, опосредующих нейроваскулярную коммуникацию, включая пути WNT, NOTCH и NCAM.

Ученые исследовали, влияет ли наличие эндотелиального компонента на развитие церебральных органоидов. Для этого ученые объединили и интегрировали все органоиды, содержащие церебральный компонент, как отдельно, так и в сочетании с эндотелиальным органоидом, а также только эндотелиальный органоид. Клетки были объединены в кластеры на основе сигнатур экспрессии их генов. Затем был проанализирован вклад каждого органоида в полученные кластеры. Что касается церебрального компонента, то не наблюдалось значимого влияния присутствия эндотелиальных клеток. Это позволило сделать вывод о том, что эндотелиальные клетки в первую очередь влияют на развитие заднего мозга, а не головного.

Изображение №4

Анализ паттернов нейронной активности выявил различные траектории развития для различных типов органоидов в течение 30-дневного периода (35–65 день). Было обнаружено, что у многозональных органоидов мозга (MRBO) наблюдалось значительное увеличение частоты нервных импульсов и частоты залпов (серий импульсов), но соответствующее уменьшение межспайкового интервала (ISI от inter-spike interval) (4a). Обнаружено, что у органоидов головного мозга, среднего и заднего мозга (4b) траектория развития была менее выраженной. Хотя изменения частоты импульсов и частоты залпов не были значимыми, измерения ISI показали устойчивые изменения с течением времени. Однако количество импульсов на средний залп сети значительно снизилось, что указывает на совершенствование сетевой активности. Значительное увеличение как частоты импульсов, так и скорости залпов наблюдалось в органоидах среднего/заднего мозга (4c).

Средняя длительность сетевого залпа также постепенно увеличивалась, как и средний ISI внутри сетевых залпов, что указывает на созревание нейронных цепей. Церебральные органоиды (4d) демонстрировали различные паттерны активности; пик частоты импульсов наблюдался примерно на 45–55 день, а затем небольшое снижение. Однако ISI демонстрировал весьма значимые изменения, а средний ISI внутри сетевых залпов был значительно модулирован.

Все типы органоидов были проанализированы на предмет нормализованной продолжительности сети (IQR от interquartile range, т. е. межквартильный размах) (4e). Наиболее значимые изменения наблюдались в MRBO. Это предполагает улучшение динамики сети по сравнению с органоидами головного мозга и среднего/заднего мозга с течением времени. Однако различия между отдельными типами органоидов не были статистически значимыми.

В совокупности эти результаты показывают, что различные типы органоидов со временем приобретают различные электрофизиологические профили, при этом MRBO демонстрируют наиболее выраженные изменения в паттернах сетевой активности, что свидетельствует об адекватной интеграции различных областей мозга для выполнения функций.

Изображение №5

Для дальнейшей валидации результатов одноядерного секвенирования РНК (sc-RNA seq) в отношении клеточного состава и идентичности органоидных систем ученые использовали объемное секвенирование РНК и иммуногистохимию. Анализ объемного секвенирования РНК выявил транскрипционные профили, различающие органоиды головного мозга, среднего/заднего мозга и эндотелия, а также экспрессию регион-специфичных маркеров (5a). Визуализация данных с помощью тепловой карты показала высокую экспрессию кортикальных маркеров (желтый кластер), маркеров среднего/заднего мозга (зеленый кластер) и эндотелиальных маркеров (коричневый кластер) в соответствующих типах органоидов, что подтверждает правильность регионарной спецификации.

Количественный анализ ключевых клеточных маркеров в MRBO показал, что имелось существенное присутствие разнообразных типов клеток, с присутствием CD31, SV2A, VAChT и CD34-позитивных клеток (5b). Эта количественная оценка показала, что слитая структура органоида действительно содержала множественные клеточные линии, присутствующие и хорошо сохранившиеся. Иммуногистохимическая характеристика 2-месячных MRBO показала сильную экспрессию регион-специфических маркеров (5e). Присутствие PHOX2B подтвердило идентичность заднего мозга; CD34 подтвердил эндотелиальный компонент; SV2A указал на зрелое синаптическое развитие; а Cux1 и β-тубулин показали успешную нейрональную дифференцировку и созревание.

Церебральные органоиды имели сильную экспрессию основного белка миелина (MBP) и маркера CUX1 для слоя II/III коры (5f). Nestin в срезах подтвердил, что кортикальное развитие и созревание были должным образом рекапитулированы. Органоиды среднего/заднего мозга (MHO) также экспрессировали множественные маркеры спецификации, такие как MAP2, TH и PHOX2B (5e).

Ангиогенез и начало формирования новых кровеносных сосудов были очевидны при анализе визуализации живых эндотелиальных клеток с использованием Dil-Ac-LD (5f). Были обнаружены клеточные и молекулярные характеристики, соответствующие ранним маркерам развития гематоэнцефалического барьера в MRBO. Ученые проверили на эндотелий, перициты, плотные контакты, транспортер и астроциты. С помощью маркеров экспрессии генов для всех (5c, 5d), так и с помощью IHC были показаны плотные контакты, такие как Z01 (5e). Двухмесячные срезы содержали множественные эндотелиальные и сосудистые маркеры, включая CD34, VEGFR2, CD31 и PDGFβ (5h). Таким образом, эти результаты предоставляют коллективную информацию и подтверждение клеточной идентичности.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые рассказали о первом в мире органоиде полного мозга на ранней стадии развития.

Большинство органоидов мозга, которые описывались ранее, являются репрезентацией одной области реального мозга человека (кора мозга, например). Однако в данном исследовании удалось вырастить «полноценный» мозг, который ученые назвали многорегиональным органоидом мозга (MRBO от Multi-Region Brain Organoids).

Для создания MRBO ученым в первую очередь необходимо было вырастить нервные клетки из отдельных областей мозга и рудиментарные формы кровеносных сосудов отдельно. Затем ученые соединили отдельные части вместе липкими белками, действующими как биологический клей, и позволили тканям образовывать связи. По мере срастания тканей они начали генерировать электрическую активность и реагировать как сеть.

MRBO сохранил широкий спектр типов нейронных клеток, по характеристикам напоминающий мозг 40-дневного человеческого плода. Около 80% спектра типов клеток, обычно наблюдаемых на ранних стадиях развития человеческого мозга, в равной степени экспрессировались в созданных в лаборатории миниатюрных мозгах. Эти органоиды значительно меньше по размеру по сравнению с настоящим мозгом (6-7 миллионов нейронов по сравнению с десятками миллиардов во взрослом мозге), и представляют собой уникальную платформу для изучения развития мозга.

Исследователи заявили, что использование органоидов целого мозга для тестирования экспериментальных препаратов также может помочь повысить процент успешных клинических испытаний. Примерно от 85% до 90% лекарств терпят неудачу в ходе первой фазы клинических испытаний. Для нейропсихиатрических препаратов этот показатель приближается к 96%. Это связано с тем, что ученые преимущественно изучают модели животных на ранних стадиях разработки лекарств. Органоиды целого мозга более точно соответствуют естественному развитию человеческого мозга и, вероятно, станут более подходящими объектами для испытаний.

Такие заболевания, как шизофрения, аутизм и болезнь Альцгеймера, поражают весь мозг, а не только его отдел. Следовательно, имея в распоряжении органоид всего мозга можно проследить, что идет не так на ранних стадиях развития, а затем выявить новые признаки развития заболевания и охарактеризовать принцип действия новых препаратов.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?