Организм человека — это, как часто говорят, сложный механизм, состоящий и множества систем, каждая из которых выполняет определенную функцию. Результат работы некоторых из них мы даже не замечаем либо не задумывается о них, другие же нам очень даже заметны. Боль тоже является важным аспектом жизни, так она сигнализирует о нарушении работы той или иной системе ввиду травмы, заболевания или других факторов. Однако есть виды боли, которые мы бы хотели никогда не испытывать, несмотря на всю важность этого сигнала организма. Одним из таких является боль при камнях в почках. Ученые из Американского химического общества (Вашингтон, США) провели исследование рептилий и того, как они справляют нужду. Как оказалось, змеи и другие рептилии образуют мелкие кристаллические шарики мочевой кислоты. Почему рептилии это делают, и какая связь между туалетными привычками змей и борьбой с камнями в почках человека? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Избыточный азот, образующийся в результате катаболического распада белков и пуринов, обычно выводится из организма в форме аммиака, мочевины или мочевой кислоты. Водные виды, как правило, выделяют аммиак — соединение токсичное, но быстро разбавляющееся в водной среде. У млекопитающих основным продуктом азотистого обмена является мочевина, выводимая вместе со значительным количеством воды в составе мочи. При этом небольшие количества аммиака и мочевой кислоты также удаляются и требуют стро��ой регуляции.

У рептилий и птиц преобладает урикотелизм — выделение мочевой кислоты в твердой форме. Эти твердые выделения обычно называют «уратами». Считается, что урикотелизм обеспечил важные эволюционные преимущества, в частности способность сохранять воду в жарких и засушливых условиях. Кроме того, он может давать дополнительные репродуктивные преимущества яйцекладущим видам, поскольку мочевая кислота в 10₄ раз менее растворима, чем аммиак или мочевина, и, следовательно, менее вероятно оказывает токсическое воздействие на развивающийся эмбрион внутри замкнутой яичной оболочки.

У человека повышенный уровень мочевой кислоты (гиперурикемия) чаще всего сопровождается ее кристаллизацией in vivo, что приводит к классическому клиническому проявлению подагры, а также к образованию некоторых типов почечных камней. В то время как большинство млекопитающих окисляют мочевую кислоту до более растворимых соединений для последующего выведения, у человека и других высших приматов фермент уриказа был мутационно инактивирован приблизительно 12–14 миллионов лет назад.

Считается, что сохранение мочевой кислоты обеспечило определенное эволюционное преимущество, связанное с ее возможной ролью в качестве антиоксиданта, регулятора иммунных сигналов и фактора, участвующего в накоплении жира. Тем не менее заметное различие между эффективным выведением больших количеств малорастворимой мочевой кислоты у рептилий и птиц и развитием кристаллических заболеваний у человека вызывает ряд вопросов. Во-первых, каким образом урикотелические виды способны эффективно справляться с выведением столь плохо растворимого соединения? И, во-вторых, какова структура и состав уратов, которые ими выделяются?

Животные ураты являются объектом научного интереса как минимум с XIX века, однако первые структурные исследования этих соединений появились лишь в конце 1960-х годов. При изучении уратов птиц геолог Фолк сообщил о наличии микронных сфер с высокой растворимостью в воде и рентгенодифракционной картиной (PXRD от X-ray powder diffraction pattern), представленной одним пиком. Эти наблюдения побудили его ошибочно заключить, что птицы не выделяют мочевую кислоту, — утверждение, противоречившее установленным научным данным и вызвавшее резкую реакцию со стороны ведущих биологов.

Впоследствии Лонсдейл и Сутор провели собственные исследования уратов волнистого попугая. Ими был подтвержден PXRD-паттерн с одним интенсивным пиком на 3.20 Å, однако было высказано предположение, что исследуемый материал представляет собой неупорядоченную слоистую форму дигидрата мочевой кислоты (UAD от uric acid dihydrate). Хотя это предположение выглядело обоснованным для своего времени, лишь спустя 26 лет кристаллическая структура UAD была окончательно установлена, и оказалось, что она не имеет ламеллярного строения.

В последующие годы появились дополнительные сообщения об уратах, выделенных у птиц, рептилий и некоторых насекомых, для которых также отмечались либо одиночный пик PXRD, либо сферическая морфология, сходная с ранее описанными наблюдениями. Тем не менее состав, структура и свойства этих биогенных микросфер оставались нерешенными научными вопросами.

В ходе предыдущих исследований было установлено, что у содержащихся в неволе змей, получавших идентичный контролируемый рацион, наблюдаются два общих типа выделения отходов, приводящие к образованию уратов с качественно различным химическим составом. После приема пищи (грызунов) у примитивных видов змей, таких как боиды и питоны, процесс выделения происходил в два этапа: сначала выделялись только ураты (U1), а затем — ураты совместно с фекалиями (U2). Оба типа выделений (U1 и U2) имели полутвердую консистенцию, которая после высыхания превращалась в плотные гранулы, характеризующиеся типичным рентгенодифракционным (PXRD) паттерном с одним интенсивным пиком.

В отличие от этого, у более эволюционно продвинутых видов змей (Colubroidea) выделение происходило однократно после кормления, при этом ураты выводились одновременно с фекалиями. Такие ураты после высыхания превращались в гранулированный порошок с PXRD-паттерном, соответствующим структуре уратов аммония.

В рассматриваемом нами сегодня труде, основанном на более обширных исследованиях уратов у королевского питона (Python regius) и более чем двадцати видов рептилий (как примитивных, так и эволюционно продвинутых) было показано, что два типа уратов, несмотря на их различия, связаны между собой через изощренную и высокоадаптивную систему управления азотом и солями. У всех исследованных видов рептилий было обнаружено образование микросфер, состоящих из нанокристаллов моногидрата мочевой кислоты. У одних видов эти микросферы выводятся непосредственно, тогда как у других нанокристаллы используют��я как реакционноспособные предшественники, позволяющие при необходимости связывать аммиак посредством рекристаллизации. Осознание этой важной функции имеет существенное значение для понимания физиологической роли мочевой кислоты.

Результаты исследования

Изображение №1

Королевский питон (Python regius), относящийся к древним видам змей, был выбран в качестве модельного урикотелического организма благодаря своему двухэтапному процессу выведения уратов, небольшим размерам, простоте содержания и мирному характеру. При кормлении лабораторными мышами взрослые особи обычно выделяют первую порцию уратов (U1) через 3–7 дней после приема пищи (1a), а вторую, меньшую по объему (U2), через 7–15 дней после первой. После особенно обильного кормления у одного взрослого самца наблюдалось и третье выделение (U3 — ураты с фекалиями).

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) показала, что ураты состоят из микросфер диаметром от 1 до 10 мкм (1b). Микросферы U1 и U2 не различаются по размерам и внешнему виду. При исследовании методом криоразлома было выявлено, что часть микросфер имеет плотную структуру, тогда как другие обладают более пористой внутренней организацией с концентрическими кольцами и/или радиальными узорами (1c).

SEM-снимки высокого разрешения поверхности микросфер показали текстуру из плотно упакованных ромбовидных частиц шириной 40 ± 10 нм и длиной 180 ± 60 нм (1e). Анализы микросфер уратов, выделяемых двумя другими древними видами змей, ангольским питоном (Python anchietae) и мадагаскарским древесным боа (Sanzinia madagascariensis), показали аналогичную текстуру, что подтверждает ее универсальный характер.

Однородность размеров наночастиц указывает на их вероятное происхождение из коллоидов, тогда как вариабельность размеров микросфер предполагает наличие отдельного механизма, собирающего наночастицы в микронные пакеты. Предполагается, что объединение наночастиц в более крупные сферические структуры улучшает их транспортные свойства, однако в настоящее время не известно, как и где именно в организме происходит этот этап сборки.

Ураты королевского питона, подвергнутые исследованию, показали один интенсивный PXRD-пик с межплоскостным расстоянием (d-spacing) 3.191 Å, низкоинтенсивный второй гармонический пик и очень слабое диффузное рассеяние в диапазоне 2θ = 10–60° (1f). FWHM (ширина на полувысоте) пика соответствует размеру кристаллита примерно 18–35 нм, что согласуется с размерами частиц, определенными методом SEM.

При истирающем измельчении микросферы разрушались (вставка на 1f), но при этом не появлялись дополнительные дифракционные линии, что исключает влияние предпочтительной ориентации в образце. Измельчение также слегка смещало положение пика до 3.212 Å и вызывало его расширение и асимметрию, что указывает на двухмерную слоистую структуру с турбостратическим нарушением упорядочения. Ураты нескольких других видов, включая примитивных змей, ящериц и одну крупную птицу, демонстрировали аналогичный дифракционный паттерн с одним интенсивным пиком около 3.2 Å.

Из множества известных форм мочевой кислоты и ее солей единственной, у которой π-слоистая структура соответствует указанному межплоскостному расстоянию, является моногидрат мочевой кислоты (UAM от uric acid monohydrate) (1g). Смоделированная PXRD-картина UAM содержит один интенсивный пик, соответствующий расстоянию между слоями, при этом все остальные пики имеют интенсивность менее 27% от основного. Турбостратическое нарушение порядка между двухмерными слоями, а возможно и внутри слоев, дополнительно снижает интенсивность остальных пиков. Данные термогравиметрии, элементного анализа и ИК-спектроскопии также соответствуют составу моногидрата. Ультравысокопроизводительная LC-MS (жидкостная хроматография - масс-спектрометрический анализ) показала, что единственной измеримой органической малой молекулой в уратах королевского питона является мочевая кислота.

Биогенные микросферы органических кристаллов (например, гуанина, птериновых пигментов и изоксантоптерина) были описаны у различных животных, где они выполняют функциональные роли в оптике и/или формировании структурного окрашивания. С эволюционной точки зрения представляют интерес возможные связи между микросферами, используемыми для оптических и выделительных функций. Однако на данный момент не ясно, каким образом эти системы могут быть связаны.

В отличие от биогенных кристаллов гуанина, которые могут представлять собой смесь гетероциклических метаболитов, отсутствие малых молекул, кроме мочевой кислоты, в выделяемых уратах является примечательным. Существуют также различия в размерах. Микросферы, используемые для оптических целей, по определению довольно однородны. Микросферы мочевой кислоты, выявленные в световом органе светлячков и в хроматофорных клетках рыб, также имеют относительно одинаковый размер.

В отличие от этого, ураты королевского питона и других рептилий состоят из микросфер различного размера. Доступные данные об уратах рептилий больше соответствуют процессу, при котором наночастицы UAM одинакового размера формируются сначала, а затем подвергаются вторичной сферификации. Это предполагает, что различные механизмы сборки микросфер мочевой кислоты могут быть реализованы в разных биологических контекстах.

Изображение №2

У рептилий существуют различные механизмы выведения солей, одним из которых является выделение уратов вместе с фекалиями. Содержимое неорганических элементов в уратах королевского питона было изучено методом полуквантитативного SEM-EDX (сканирующая электронная микроскопия - энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия), который показал низкий уровень K₊ (<5 мас.%) и еще меньшие количества Na₊, Ca₂₊ и Mg₂₊ (изображение №2). Ураты ангольского питона и мадагаскарского древесного боа имели аналогичные уровни K₊, но не содержали обнаруживаемых количеств двухвалентных ионов.

Примечательно, что концентрации выявленных методом EDX неорганических ионов были значительно ниже ожидаемых для стехиометрических солей. Ранее проведенные исследования методом EDX у микросфер уратов различных видов птиц также показали присутствие неорганич��ских ионов в переменных соотношениях. В некоторых образцах наибольшая концентрация приходилась на ионы калия, тогда как в других Ca₂₊ или Na₊ присутствовали в больших количествах. Эта вариабельность, вероятно, связана с различиями в рационе или другими метаболическими факторами.

Тем не менее, если как у птиц, так и у рептилий образуются нанокристаллические микросферы UAM, их способность включать в себя разнообразные ионы металлов в переменных концентрациях имеет важное функциональное значение. Предыдущие исследования однокристаллов безводной мочевой кислоты (UA от uric acid) показали, что поверхности кристаллов несут слабый отрицательный заряд из-за депротонирования некоторых молекул на поверхности при нейтральном pH (pK^a мочевой кислоты ≈ 5.4). Аналогично, можно ожидать, что молекулы на поверхности нанокристаллов UAM также способны ионизироваться.

Учитывая высокую удельную поверхность нанокристаллов, можно предположить, что большая часть щелочных и щелочноземельных металлов в микросферах ассоциирована с поверхностями UAM. Эта модель не исключает того, что часть ионов металлов может находиться в других областях, например, в менее упорядоченных пространствах между кристалллитами или даже в виде незначительных примесей внутри UAM. Способность материала с большой поверхностью изменять заряд на поверхности в ответ на состав пищи обеспечивает низкоэнергетическую, но высокоадаптивную платформу для осморегуляции. Это позволяет учитывать различные размеры катионов, их заряды и концентрации, обеспечивая возможность при необходимости в��водить или удерживать соли.

Хорошо известно, что мочевая кислота может существовать в нескольких различных кристаллических формах в биогенных средах. Например, отложения при подагре состоят из моногидрата моноурата натрия (MSU от monosodium urate monohydrate), тогда как в человеческих почечных камнях мочевая кислота чаще всего встречается в виде ангидрата (UA от anhydrate) или дигидрата (UAD от dihydrate). При этом форма UAM была однозначно идентифицирована лишь однажды — в единственном образце почечного камня, из-за чего долгое время считалось, что она чрезвычайно редка. Парадоксальным образом в настоящем исследовании было показано, что именно форма UAM может являться наиболее часто образующейся формой мочевой кислоты на планете. Возникает вопрос: почему же UAM наблюдалась столь редко?

Различные кристаллические формы обладают разной термодинамической стабильностью, что допускает возможность превращения метастабильной фазы в более энергетически устойчивую. Например, было показано, что синтетический дигидрат мочевой кислоты (UAD) рекристаллизуется в растворе в ангидрат (UA) — более стабильную и менее растворимую форму.

Изображение №3

Для оценки относительной стабильности водная растворимость микросфер UAM, полученных от королевского питона, была определена с использованием ферментного флуоресцентного анализа и напрямую сопоставлена с аналогичными измерениями для форм, чаще встречающихся в конкрементах (3a). Повторные измерения образцов мочекислых солей питона U1, U2 и U3, хранившихся при комнатных условиях около 4.5 месяцев, показали эквивалентную растворимость в пределах погрешности эксперимента, однако она оказалась в 20–40 раз выше, чем у синтетических MSU и UA. При повторном тестировании части того же образца U1 спустя примерно 25.5 месяцев растворимость оказалась примерно вдвое ниже по сравнению со свежими уратами, что было обусловлено трансформацией образца.

Данные PXRD, собранные для того же образца U1 в течение двухлетнего периода, подтвердили, что часть UAM со временем превращается в UAD и UA (3b). Анализ отдельных фрагментов, выделенных из более крупного уратного осадка, показал, что трансформация происходит преимущественно во внешних слоях, тогда как внутренняя часть сохраняет форму микросфер.

Таким образом, снижение растворимости в стареющих образцах может быть связано с образованием менее растворимой «корки», которая фактически инкапсулирует микросферы и препятствует их растворению. Однако отмечается, что анализ нескольких десятков уратов, хранившихся длительное время в тех же условиях, показал — не все образцы претерпевают данное превращение с одинаковой скоростью. Некоторые ураты, пролежавшие до трех лет, сохраняли однопиковый PXRD-профиль, характерный для UAM. В то же время небольшие количества UAD иногда обнаруживались даже в свежих уратах, исследованных менее чем через неделю после их выделения.

Склонность микросфер UAM к превращению в UAD и UA, по-видимому, связана с исходным содержанием воды в выделенной полутвердой массе либо со скоростью, с которой уратный осадок затвердевает. Для проверки этой гипотезы ураты королевского питона были подвергнуты воздействию различных внешних условий. Свежевыделенные ураты, помещенные в водную среду, быстро рекристаллизовались в формы UAD и UA. Аналогичное превращение наблюдалось и при нагревании микросфер UAM на воздухе при температуре 225 °C в течение нескольких часов, о чем свидетельствовало появление прозрачных кристаллов UA среди микросфер (3c). Эти условия ускоренного старения одновременно подтверждают метастабильность формы UAM и подчеркивают значимость истории образца и внешней среды при структурных исследованиях биогенных форм мочевой кислоты.

Изображение №4

Из более чем 4000 современных видов змей феномен двухфазного выделения уратов до сих пор известен лишь у представителей древних линий (семейства Boidae и Pythonidae) и, очевидно, не является повсеместным. Большинство современных видов змей, как правило, выделяют ураты и фекалии одновременно, при этом уратные выделения после высыхания превращаются в зернистый порошок (4a, 4b).

Рентгенодифракционный (PXRD) анализ уратов нескольких представителей семейства Colubroidea показал дифрактограммы, близкие по структуре к аммонийным уратам, хотя биогенные аммонийные ураты известны своей крайне низкой кристалличностью. Согласно недавним исследованиям, была идентифицирована вторая фаза — гидрат аммонийного урата (AUH от ammonium urate hydrate), при этом было установлено, что биогенный аммонийный урат лучше описывается как смесь гидратированной и безводной форм. Дифрактограммы этих двух форм имеют перекрывающиеся пики при низких углах 2θ, однако различаются по наиболее интенсивным пикам при более высоких углах.

При микроскопическом исследовании десятков уратов, выделенных представителями семейства Colubroidea, неизменно обнаруживались примеси других кристаллических форм среди гранул аммонийного урата. В отдельных случаях наблюдались кристаллы UAD, а в других — четко различались микросферы (4c, 4d). Выявление микросфер в данных образцах стало ключевым моментом для понимания процесса, поскольку ранее предполагалось, что различия в составе уратов могут быть следствием разных механизмов метаболизма мочевой кислоты. Наличие микросфер UAM в аммонийно-уратных выделениях подтвердило их распространенность среди разных видов змей. Более того, данные орнитологических исследований, а также собственный анализ уратов, полученных от большого нанду (Rhea americana), указывают на то, что нанокристаллические сферы UAM представляют собой систему утилизации продуктов обмена, общую для значительно более широкого круга как птиц, так и рептилий. Вероятно, это отражает их общее, хотя и отдаленное, эволюционное происхождение.

Тем не менее совокупность полученных наблюдений вызывает новые вопросы. Из всех возможных форм мочевой кислоты почему именно метастабильная кристаллическая форма могла быть выбрана эволюцией в качестве основного механизма выведения продуктов обмена? Возможно, высокая водная растворимость такой формы способствует экономии воды, позволяя более эффективно осуществлять ее обратное всасывание при сниженном риске кристаллизации in vivo. Наличие микросфер в уратах Colubroidea указывает на еще одно возможное объяснение. Если нанокристаллы UAM действительно являются функциональными предшественниками аммонийного урата, это может свидетельствовать о фундаментальной роли мочевой кислоты в регуляции аммонийного обмена. Высокая растворимость вновь становится преимуществом в рамках такого механизма.

У животных, выделяющих аммонийный урат, неизбежно происходит образование значительных количеств аммиака — либо в собственных тканях, либо с участием симбиотических бактерий. Аммиак представляет собой нейротоксин и потенциальную контактную угрозу для наземных видов, лишенных конечностей. Связывание аммиака в твердую форму значительно снижает его токсичность. Для гремучих змей и других представителей Colubroidea в естественных условиях образование гранулированных отходов, легко рассеиваемых ветром, может обеспечивать дополнительные преимущества — например, снижение вероятности обнаружения хищниками и повышение эффективности засады при охоте. С термодинамической точки зрения реакция микросфер UAM с аммиаком является вполне вероятной, поскольку аммонийный урат обладает еще меньшей растворимостью, чем UA. Возможность напрямую выделять микросферы либо использовать их в качестве функциональных предшественников для связывания аммиака по мере необходимости представляет собой весьма изящный и эффективный биологический механизм нейтрализации данного токсичного соединения.

В качестве доказательства концепции того, что микросферы UAM могут служить функциональными предшественниками аммонийного урата, ураты королевского питона были погружены в водный раствор гидроксида аммония при комнатной температуре. Реагировавший образец быстро приобрел зернистую структуру (4e) и показал PXRD-паттерн, поразительно схожий с таковым для аммонийных уратов, выделенных у Colubroidea. Уточнение структуры методом Ритвельда показало 86 % гидрата аммонийного урата (AUH) и 14 % микросфер при R^wp = 4.79 %. Химический состав полученного материала согласовывался с данными Фурье-ИК-спектроскопии (4f) и элементного анализа при сжигании. Тепловые свойства реагировавших микросфер также оказались аналогичны характеристикам синтетического гидрата аммонийного урата, стабильного при температурах ниже 150 °C и быстро разлагающегося при нагревании выше 270 °C.

Настоящее исследование уратов у рептилий указывает на возможность того, что мочевая кислота может выполнять аналогичную детоксикационную функцию в отношении аммиака и у других видов. Признавая наличие существенных физиологических различий между рептилиями и человеком, вновь возникает вопрос: почему у людей присутствует неактивная форма фермента уриказы Если низкие концентрации мочевой кислоты действительно способны защищать организм от повышенного уровня аммиака, это могло бы служить убедительным объяснением эволюционной выгоды, связанной с инактивацией уриказы.

И мочевая кислота, и аммиак являются естественными компонентами человеческих биологических жидкостей. Было показано, что между концентрацией мочевой кислоты в сыворотке крови и рядом заболеваний существует U-образная зависимость, что свидетельствует о ее защитном эффекте при низких уровнях. Хотя форма UAM крайне редко выявляется в человеческих уролитах, сама гипотеза о роли мочевой кислоты в детоксикации аммиака не требует обязательного участия именно этой фазы. Повышенная растворимость UAM, вероятно, имеет значение для рептилий, которым необходимо сохранять воду в засушливых условиях. У человека, для которого водный баланс менее ограничен, связывание аммиака могло бы происходить просто с участием растворенной мочевой кислоты. Важно отметить, что даже при оптимальных условиях синтеза кристаллы аммонийного урата достигают максимальных размеров менее 2 мкм в диаметре. Следовательно, если подобные структуры действительно образуются in vivo, они, скорее всего, могут естественным образом выводиться с мочой, не вызывая неблагоприятных последствий.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде анализ уратов, выделяемых различными представителями чешуйчатых рептилий, позволил прояснить ключевые особенности изящной и гибкой системы, используемой этими животными для регуляции азотистого обмена и солевого баланса. С учетом контроля рациона, понимания влияния условий хранения и старения образцов на результаты анализа, а также благодаря современным аналитическим методам, данное исследование предоставляет гораздо более детализированное представление о структуре и функциях биогенных уратов.

Вопросы о том, где и каким образом формируются микросферы, остаются открытыми и представляют особый интерес. Однако тот факт, что их продуцируют самые разные урикотелические виды, указывает на существование малозатратного энергетически выгодного процесса, сформированного под действием сходных эволюционных факторов.

Осознание того, что мочевая кислота участвует в регуляции аммиачного обмена, может иметь более широкие последствия для понимания человеческой физиологии и здоровья, хотя для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие клинические исследования.

Немного рекламы

Спасибо, что остаетесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?