Есть такая шутливая отговорка «ничегонеделанья»: я не бездельничаю, на молекулярном уровне я очень занятой человек. И как в любой другой шутке, в этой также есть доля правды. Каждую секунду вокруг нас и внутри нас происходит множество незаметных глазу процессов. Некоторые их них до сих пор остаются объясненными лишь на теоретическом уровне без фактического наблюдения. Однако это может скоро измениться. Ученые из Токийского университета разработали новый метод высокоскоростной съемки, позволяющий запечатлеть движение единой молекулы. Насколько скоростной оказалась съемка, каков ее принцип работы и составляющие? Об этом мы узнаем из доклада ученых.

Основа исследования

Изучение наноразмерных процессов, явлений и элементов существует уже достаточно давно, однако в нем есть определенные ограничения. Рассмотреть совокупность молекул или даже одну молекулу, которые неподвижны, не составляет особого труда. А вот провести наблюдения за фактическим движением столь малого объекта в реальном времени — задача куда серьезнее. Одним из осложняющих факторов являются флуктуации окружающей среды. Ученые приводят в пример молекулы в углеродной нанотрубке (УНТ)*, где они сильно взаимодействуют с флуктуациями среды. За счет этого механика процесса становится нелинейной, стохастической и даже неповторяемой. Другими словами, процесс становится слишком непредсказуем и скоротечен, чтобы современные средства наблюдения могли его зафиксировать.

Углеродные нанотрубки (УНТ)* — модификация углерода, имеющая форму полого цилиндра, диаметр которого измеряется нанометрами.

В данном труде ученым все же удалось достичь весьма впечатляющих результатов. Они провели наблюдение движения, вращения и взаимодействия одиночных молекул с механически вибрирующей углеродной нанотрубкой (1а и 1b).


Изображение №1

Для этого был использован электронный микроскоп с коррекцией аберраций, DED-камера для прямого наблюдения электронов и специальную методику шумоподавления за счет вариации (Chambolle total variation, An Algorithm for Total Variation Minimization and Applications).

Метод шумоподавления за счет вариации* основан на принципе, согласно которому сигналы с чрезмерной и, возможно, паразитной, детализацией имеют большую вариацию, т.е. интеграл абсолютного градиента сигнала является высоким. Согласно этому принципу, уменьшение общей вариации сигнала при условии, что он близок к исходному, удаляет нежелательные детали (шум), сохраняя при этом важные детали, такие как края и углы заснятого объекта.

Вариация* — числовая характеристика функции одного действительного переменного, связанная с её дифференциальными свойствами.


По мере того, как зеленый шар перемещается по графику данной функции, длина пути, пройденного проекцией этого шара на оси у (т.е. красного шара), является полной вариацией функции.

Использование вышеперечисленных техник позволило зафиксировать сильно коррелированные движения УНТ, которая стохастически колеблется несколько раз в секунду, и молекулы, которая перемещается стохастически в течение 1.875 мс (миллисекунд). Ученые отмечают, что этот молекулярный «поезд» приставляет собой прототип одномолекулярной машины «частица в коробке», где частица имеет конечную массу с потенциалом, показанным на изображении 1с.

«Прыгающее» движение димеров* С60 в УНТ ранее предполагалось как нетепловое событие, что подтверждается температурной нечувствительностью частоты событий.

Димер* — сложная молекула, которая состоит из двух или более обычных молекул.

Посредством электронной микроскопии с атомарным разрешением в реальном времени (SMART-EM от single-molecule atomic-resolution real-time electron microscopy) удалось обнаружить богатую динамику, когда кинетическая энергия периодически подается от механически вибрирующей УНТ к молекуле, а УНТ деформировался движущейся молекулой. Исследователи заявляют, что это наблюдение первое в своем роде.

Новая методика позволяет проводить нанометровые, молекулярные и атомарные исследования, погрешность которых не будет превышать 0.9 мс и 0.01 нм.

Настройка экспериментальной установки

ЭМ-наблюдения с атомным разрешением проводились с помощью микроскопа JEOL JEM-ARM200F, оборудованном корректором аберрации. Ускоряющее напряжение составило 80 кВ, а давление внутри камеры для образцов 1х10^–5 Па.


Микроскоп JEOL JEM-ARM200F

Микроскоп был размещен на специальной антивибрационной плите, которая в свою очередь была размещена на основе из бетона толщиной 5 метров, что позволило минимизировать механические вибрации.

Серия ЭМ снимков была записана со скоростью 0.625 мс/кадр с помощью DED-камере (размеры выходного изображения составили 414 на 1920 пикселей) с разрешением пикселей 0.021 нм при увеличении х400000. Все изображения были автоматически обработаны с помощью программного обеспечения Gatan DigitalMicrograph.

Сначала было проведено исследование нескольких молекул С60, инкапсулированных в УНТ, с увеличением х400000 на CMOS-камере (4096 ? 4096 пикселей) для поиска молекул в УНТ, которые подходят для проведения дальнейшей фиксации их движения и реакции. После нахождения подходящего кандидата, луч лазера был отключен методом гашения. Далее необходимо было подождать минуту, дабы прекратился тепловой дрейф.

Следом за этим камеру предыдущую заменили на K2-IS и начали запись видео. Изображения собирали в формате .dm4 с помощью программного обеспечения Gatan DigitalMicrograph и обрабатывали с использованием программного обеспечения ImageJ 1.47t.

Чтобы устранить неравномерность электронного облучения, все изображения были обработаны полосовым фильтром (исключались структуры менее 3 пикселей и более 40 пикселей, допуск* направления: 5%) и отрегулированы по яркости и контрасту.

Допуск* — разница между наибольшим и наименьшим предельными значениями какого-либо параметра.

Ориентация УНТ на всех ЭМ изображениях и моделях была повернута так, чтобы УНТ были горизонтальны в каждом кадре.

Подготовка C60@УНТ осуществлялась следующим образом. Сначала порошок УНТ постепенно нагревали от 296 К до 793 К в течение 12 минут, выдерживали при 793 К в течение 1 минуты, далее опять нагревали от 793 К до 823 К в течение 20 минут и опять выдерживали при 823 К в течение 20 минут. Этот процесс позволил удалить «колпачки» нанотрубок, то есть из капсул сделать полые цилиндры.

Для инкапсуляции молекул C60 открытые УНТ (0.2 мг) и порошок C60 (0.2 мг) были запечатаны в стеклянную трубку под давлением 2х10^–4 Па и постепенно нагревались от 296 до 573 К в течение 1 часа, затем до 673 К в течение 1 часа и выдерживались при 673 К в течение 72 часов. Полученные С60-содержащие УНТ механически отделяли от оставшегося порошка С60, промывали толуолом (PhMe) для удаления С60 с поверхности и сушили в вакууме. Полученный таким образом C60@УНТ представляет собой черное твердое вещество (0,3 мг).

Результаты экспериментов

Ввиду того, что движения внутри углеродной нанотрубки происходят стохастически, т.е. случайный образом, использовать классические методы наблюдения не получится, как заявляют ученые. Однако применение ЭМ-визуализации меняет ситуацию.

Например, 78-миллисекундные видеоизображения (1d) иллюстрируют перемещения и вращение димера C60 (6–7 светло-синего цвет на изображении). Даже с таким ограниченным временным разрешением, как на 1d, можно отчетливо увидеть вертикальные полосы с периодичностью 0.21 нм за счет зигзагообразных цепей графитовой решетки (1b).

Подобные вертикальные полосы появляются лишь на нижней боковой стенке, что указывает на абсолютную стереохимию этой УНТ, являющейся спиральной. Факторы, ограничивающие потенциал ЭМ, включают низкий контраст изображения из-за малого поперечного сечения световых элементов, отсутствие пространственной периодичности молекулярных образцов и определенные характеристики ЭМ и детектора (аберрация, пространственное и пиксельное разрешение, частота кадров, сигнал и интенсивность шума).

Одна только сверхбыстрая камера не решает проблемы, говорят ученые. Так как высокая частота кадров пропорционально уменьшает дозу электронов на кадр, делая однокадровое изображение практически невидимым.

Существующая стратегия шумоподавления CTV в сочетании с быстрой камерой DED позволяет достичь временной точности в 0.9 мс и точности локализации в 0.01 нм для получения изображений непериодических молекулярных структур. Разрешение по времени в 2.5 мс до сих пор было самым быстрым временным разрешением ЭМ, зарегистрированным для визуализации развития кристаллической грани.

Одной из основных задач в проведенных экспериментах было получение молекулярных изображений со сверхбыстрой камеры, которая выдает 1600 кадров в секунду (или 0.625 мс/кадр; 0.021 нм х 0.021 нм пиксель^–1 при увеличении х400000).


Изображение №2

Отношение сигнал/шум (SNR) составляет всего 0.05, и в одном кадре практически не обнаруживаются какие-либо молекулы или УНТ (2а). При такой частоте кадров один пиксель получает только 4.4 электрона на кадр (или 10000 е^–нм^–2) при безопасной для детектора мощности дозы электронов (EDR) в 1.6 х 107 е^– нм^–2с^–1. Только после наложения 50 кадров (31.25 мс/кадр) методом усреднения пикселей молекулярные изображения становятся достаточно четкими (2b; SNR = 0.20). Молекулы слева проявляют контакт Ван-дер-Ваальса (межмолекулярное расстояние d = 1.01 нм), в то время как молекулы в центре это [2 + 2] димер (d = 0.90 нм; 2b).

Тем не менее при наложении теряется преимущество камеры со скоростью 1600 кадров в секунду, поскольку коэффициент усиления SNR пропорционален квадратному корню из времени экспозиции, по отношению к которому временное разрешение обратно пропорционально.

Ученые говорят, что нельзя полагаться на методы повышения контрастности для визуализации движущихся объектов. Вместо этого было решено опробовать методы обработки «сырых» ЭМ-изображений. Во время поиска подходящей методики было установлено, что шумоподавление CTV и суперпозиция демонстрируют хороший баланс между уменьшением шума и сохранением исходных сигналов (в частности, информация о границах объекта, необходимая для молекулярной визуализации). Таким образом, были получены 0.625 мс/кадр изображения с SNR = 0.15, где удалось идентифицировать молекулы (2с). После одновременной трехкадровой суперпозиции CTV и шумоподавления (1.875 мс/кадр; 2d) стали отчетливо видны молекулы с SNR = 0.30. Следовательно, данная методика позволяет получить вразумительный SNR в 17 раз более высокой частоте кадров (сравнение 2b и 2d).



Получив желаемые снимки и видео, ученые приступили к анализу данных, т.е. к анализу движения димера С60 в углеродной нанотрубке.

Посредством наблюдения примерно 400 молекул в УНТ в течение общего времени наблюдения в 10 минут при 0.625 мс/кадр (всего примерно 380 миллионов изображений C60) удалось обнаружить несколько десятков событий движения, происходящих менее чем за <1.875 мс. Из них было выбрано два события, где можно было провести точный анализ. Все остальные были не столь подходящи по ряду причин, в том числе и из-за чрезмерной вибрации УНТ.

Изображение 2е показывает те же молекулярные события, что и на 1d, но с частотой кадров в 18 раз выше (4.375 мс/кадр), демонстрируя, что димер (6–7) двигался в кадре 297.8125–302.1875 мс, где видно слабое изображение димера (окрашен в светло-синий).

При высокой частоте кадров 1.875 мс/кадр на изображении 3а заметно, что перемещение и вращение димера (6–7) сильно коррелируют с вибрацией и деформацией УНТ.


Изображение №3

В данном случае была произведена оценка ряда параметров (в нм): x (движение молекулы из источника), y (боковое смещение центра УНТ) и z (диаметр УНТ).

В последовательности кадров с (ii) по (iv) на 3а димер перемещался между 299.0625 и 300.9375 мс (300 ± 0.9375 мс, окрашенный в светло-синий), пока не достиг молекулы 8. На изображении 3b синим цветом показано количественное суммирование движения димера (х) и вибрации УНТ (y), происходящей примерно 10 раз в течение 1000 мс с амплитудой 0.1 нм или менее. Тут одно из событий вибраций привело к событию движения, возникшему 300 мс спустя.

Как видно на 3с, движение (синяя пунктирная линия) произошло через 10 мс после вибрации УНТ с максимальной амплитудой в момент 290 мс (розовая сплошная линия), где димер получает достаточно кинетической энергии для разрыва контакта Ван-дер-Ваальса со своим соседом 4–5. Димер 6–7 вращался во время движения. Таким образом, смещение вправо происходило, когда УНТ меняло направление вибрации с отрицательного на положительное направление (3d), кроме этого имело место продольное вращение. Тут диаметр УНТ мало изменился (< ± 0.05 нм) во время движения (зеленый на 3b).


Изображение №4

На изображении 4а видны дополнительные доказательства связи между движением/вращением молекулы и вибрацией углеродной нанотрубки. Тут олигомер* неправильной формы, состоящий как минимум из 7 молекул С60, перемещался назад-вперед три раза по одинаковой оси каждый раз. Каждое из этих трех событий запускалось вибрацией УНТ (сравнение х и y на 4b).

Олигомер* — молекула, напоминающая по форме цель, состоящую из небольшого числа одинаковых составных звеньев.

Как показано на 4c, 4d и 4e, все события движения (синяя пунктирная линия) происходили в течение 11–40 мс времени максимального смещения вибрации УНТ (розовая сплошная линия).

Таким образом, два события перемещения вправо имели место, когда УНТ изменяла направление вибрации с положительного на отрицательное латеральное (4c и 4e), а одно событие перемещения влево (4d) имело место при изменении с отрицательного на положительное.

Движение олигомера вызывало деформацию УНТ на 19% за время наблюдения в 1.8 с (зеленый на 4b). Это указывает на то, что кинетическая энергия, передаваемая олигомеру от вибрации УНТ, была достаточно большой, чтобы деформировать УНТ.

Стоит отметить, что движение димера (в момент 300 мс; 3b) и олигомера (в момент 650 мс; 4b) происходило без изменения диаметра УНТ (z). Из этого следует, что деформация, наблюдаемая в момент 1025 и 1519 мс на 4b, является результат движения, а не наоборот.

Совокупность полученных данных позволила ученым сделать несколько важных выводов.

Во-первых, событие вибрации УНТ, наблюдаемое в реальном времени в миллисекундном временном масштабе, происходило стохастически примерно 10 раз в секунду. А такая частота слишком мала, чтобы приписать ее тепловым движениям.

Во-вторых, события движения синхронизируются с вибрацией УНТ, происходя стохастически от нескольких до нескольких десятков раз в минуту как при 298 К, ??так и при 423 К. Эта температурная нечувствительность частоты движения резко контрастирует с температурной зависимостью скорости реакции димеризации C60.

В-третьих, тесная корреляция между движением молекул и движением УНТ исключает возможность того, что движение было вызвано прямой электронной бомбардировкой молекулы C60.

В-четвертых, события движения сопровождали вращение молекул.

В-пятых, была обнаружена любопытная корреляция между направлением колебаний УНТ и перемещением молекул. Это позволяет предположить, что спиральный потенциал в УНТ может играть важную роль в этом процессе.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

Если чего-то не видно, это еще не значит что его нет. Многие процессы, явления и их участники остаются невидимы человеческому глазу ввиду своей скоротечности и малых размеров. Развитие методик визуализации наноразмерных элементов позволяют лучше понять механизмы, управляющие процессами, которые протекают вокруг нас.

В данном труде ученые смогли заснять движение молекулы в углеродной нанотрубке. Полученные данные выявили связь между движением молекул и движением самой трубки. То, что ранее могло приписываться тепловым процессам, к ним не относится, как показали эксперименты.

Новая разработка, в которой сопряжены высокоскоростная камера, современная методика шумоподавления и крайне точный электронный микроскоп, позволяет значительно точнее изучать микроскопический мир. В дальнейшем ученые планируют расширить возможности своего изобретения, ибо микромир скрывает еще много секретов, которые ученым не терпится раскрыть.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и хорошей всем рабочей недели, ребята. :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Equinix Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?