Многие годы человек использует искусственные полимеры для создания различных устройств, предметов быта, одежды, строительных материалов и т.д. Без них сложно представить современный мир таким, каким он есть сейчас. И как бы ни хотелось, чтобы все вокруг было природным, достичь такой экологической утопии невозможно. Ведь если делать что-то из природного материала, значит его нужно где-то добыть. Другими словами, где-то прибыло, а где-то убыло. Посему ученые со всех уголков планеты тратят уйму времени на создание искусственных материалов, которые по своим свойствам и характеристикам будут практически идентичны своим натуральным эквивалентам. К примеру, исследователи из университета Вашингтона в Сент-Луисе (США) разработали методику синтеза мышечных волокон, в котором участвуют бактерии. Как работает методика, насколько натуральными кажутся полученные волокна, каковы их свойства, и где их можно применить? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Природа всегда была источником вдохновения для ученых, независимо от направления их исследований. Что касается создания материалов, то природа также является примером для подражания, так как она способна создавать множество высокоэффективных биоразлагаемых материалов из возобновляемого сырья с помощью низкоэнергетических процессов. Яркими примерами такого творения являются шелк пауков, биссус мидий, перламутр наутилуса или резилин насекомых. Каждый из этих материалов уникален в своих свойствах, растяжимость, прочность, гибкость и т.д.

Для производства чего-либо такие материалы буквально на вес золота. Проблема в том, что сам процесс природного синтеза крайне сложен и его нельзя масштабировать до промышленных масштабов. Если же использовать природных производителей, то это займет уйму времени и сильно ударит по популяции того или иного вида. Следовательно, есть большой спрос на создание искусственных аналогов.

Говоря о промышленных масштабах мало кто подумает о микроорганизмах, но именно они помогают в решении вышеописанной проблемы. Несмотря на то, что искусственно созданные микробы успешно используются для масштабируемого производства большого количества низкомолекулярных соединений, прямое микробное производство полимерных материалов с высокими механическими характеристиками пока не сильно развито.

Многие высокоэффективные природные материалы основаны на белках, и их превосходные механические характеристики обусловлены иерархической структурой белков сверхвысокой молекулярной массы (UHMW от ultra-high molecular weight) с очень повторяющимися аминокислотными последовательностями. Производство этих UHMW белков внутри микробов крайне затруднено генетической нестабильностью, низкой эффективностью трансляции и метаболической нагрузкой.

К примеру, мышечный белок титин (или коннектин, тайтин) наделяет мышечную ткань комбинацией пассивной прочности, демпфирующей способности и быстрого механического восстановления. Все это возможно благодаря его сверхвысокой молекулярной массе (> 3 МДа) и высокоповторяющейся последовательности, состоящей из сотен свернутых доменов иммуноглобулина (Ig) (1а).


Изображение №1

Такие свойства не могли не вдохновить ученых на создание искусственных аналогов титина. Однако его размер и повторяющаяся последовательность сильно осложняют процесс синтеза. Работы по рекомбинантному производству белков титина смогли похвастаться экспрессией лишь коротких фрагментов (обычно 8–12 доменов Ig) белка.

В рассматриваемом нами сегодня исследовании ученые предложили свой метод решения проблемы микробиологического производства сверхвысокомолекулярных (UHMW) белковых полимеров. Генетическая нестабильность и низкая эффективность трансляции были преодолены с помощью полимеризации белков in vivo (т.е. в живой ткани), катализируемой расщепленными интеинами (SI от split-intein) в бактериях Escherichia coli (1b).

Результаты исследования

Чтобы обеспечить эффективное микробное производство UHMW белков титина, необходимо было генетически соединить C- и N-концевые половины быстро реагирующей пары SI (gp41-1) с N- и C-концами относительно короткой субъединицы титина, содержащей четыре домена Ig, что дает химерный белок Int^C-4Ig-Int^N (1b).

SI катализируют спонтанные реакции сплайсинга, ковалентно связывая своих партнеров по слиянию через пептидную связь и оставляя только несколько остатков (≤ 6) в области лигирования с минимальным влиянием на свойства получаемого продукта.

Чтобы минимизировать внутримолекулярное лигирование и циклизацию, нужно было полимеризовать относительно жесткую субъединицу из четырех доменов Ig (I67–I70, далее 4 Ig) из I-полосы титина камбаловидной мышцы кролика (1b). Кристаллическая структура 4 Ig предполагает структурную жесткость и показывает, что N- и C-концы субъединицы пространственно противоположны и разделены примерно на 16.4 нм.

Далее химерный белок Int^C-4Ig-Int^N и 4 Ig без SI экспрессировали отдельно в культурах E. coli во встряхиваемых колбах. Анализ SDSPAGE (электрофорез белков в полиакриламидном геле) показал, что клетки, экспрессирующие мономер 4 Ig, давали единственную полосу с ожидаемой молекулярной массой в 43 кДа. Но вот клетки, экспрессирующие Int^C-4Ig-Int^N, давали кластер UHMW продуктов массой вплоть до 460 кДа. Эксклюзионная хроматография (SEC) подтвердила, что очищенные полимеры титина действительно являются сверхвысокомолекулярными. Даже без учета этой сверхвысокомолекулярной доли полученного белка средняя молекулярная масса (Mw) полимера титина была оценена в 2.4 МДа. Между тем, SEC-анализ очищенного мономера выявил острый пик элюента*, который примерно соответствовал ожидаемой молекулярной массе мономера (43 кДа).

Элюент* — подвижная фаза (газ или жидкость) протекающая через неподвижную фазу в хроматографической системе.

Круговой дихроизм (CD от circular dichroism) был использован для исследования вторичной структуры очищенного и повторно свернутого полимера. CD созданного белка показал спектры, которые соответствуют спектрам экстрактов природного белка титина (2а).


Изображение №2

Дальнейшая деконволюция и распознавание свертывания с помощью инструмента BeStSel предполагает высокую степень антипараллельной структуры β-листов (вставка на 2а) и иммуноглобулиноподобную топологию.

Кроме того, STEM микроскопия очищенного полимера титина (2b) показала присутствие многочисленных наноразмерных фибрилл из цепочек гранул с диаметром поперечного сечения (6.1 ± 1.2 нм), соответствующего оному у природного титина.

Все вышеперечисленные результаты различных анализов полностью подтверждают, что микробная система способна синтезировать сверхвысокомолекулярные полимеры титина со значительной степенью свернутых структур, аналогичных естественным доменам Ig.

На следующем этапе исследования ученые решили преобразовать полученный синтетический титин в моноволокна макромасштабного размера.

Ученые отмечают, что сети межцепочечных кристаллитов, служащие нековалентными поперечными связями, встроенными в аморфную матрицу, могут обеспечивать высокую прочность и ударную вязкость на макроуровне. Если полимер повторно свернуть из денатурированного состояния при высокой концентрации, устойчивое сворачивание доменов Ig может способствовать образованию сети межцепочечных β-листовых кристаллов.

Посему полимер титина растворили в денатурирующем растворителе гексафторизопропаноле (HFIP), а затем экструдировали полученную пасту через иглу с узким отверстием в воду с целью ускорения рефолдинга титина во время формирования волокна.

Микроскопия образца выявила цилиндрические моноволоконные волокна с очень согласованными диаметрами примерно 10 мкм (2c и 2d). Основываясь на наблюдаемой эффективности прядения и текущих выходах белка, можно предположить, что из 1 литра культуры можно получить ~ 250 м волокна. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT-IR) сверхвысокомолекулярных волокон титина подтвердила значительный процент вторичной структуры β-листов в волокне (2f). Деконволюция амида I позволила нам оценить содержание β-листов, которое было равно около 28% (2e и 2f).

Затем была использована рамановская спектромикроскопия для изучения выравнивания β-листов вдоль оси волокна. В результате было установлено, что β-листы, сформированные во время прядения волокон, ориентированы случайным образом. Но спектромикроскопия волокон после вытягивания (2g) показала аксиально ориентированные β-листы.

Эти результаты подтверждают, что в процессе прядения получается волокно, богатое β-листами с изначально случайной ориентацией, в то время как последующая вытяжка после прядения помогает выровнять эти β-листы вдоль оси волокна.

Для дальнейшего изучения структуры сверхвысокомолекулярных волокон титина, вытянутых после прядения, была использована широкоугольная дифракция рентгеновских лучей (WAXD). Двумерные дифракционные изображения выявили два широких, но отчетливых экваториальных отражения, перпендикулярных оси волокна, а также значительные аморфные компоненты (2h-2k), характерные для полукристаллического материала.

Рассмотрение кристаллического порядка ориентации позволило проанализировать азимутальные одномерные профили двух первичных отражений и определить параметр ориентации f_crystal = 0.76 для кристаллической части волокон титина (2j и 2k). Это указывает на существенное осевое выравнивание кристаллитов. Средний размер кристаллитов вдоль оси a и расстояние d составили 1.08 нм (2h и 2i). Эти показатели хорошо согласуются со средним расстоянием (около 1.01 нм) между противостоящими β-листами индивидуальных Ig доменов в кристаллической структуре I67-I70. То, что расстояние d и размер кристаллов вдоль оси a равен 1.08 нм предполагает, что волокно титина содержит β-кристаллы двух β-листов, аналогично структуре нативного домена Ig титина.

При этом средний размер кристаллитов по оси b (ось между нитями) был 2.91 нм с расстоянием d между нитями 0.46 нм. Наблюдаемое d-расстояние между нитями согласуется со средними расстояниями между нитями антипараллельных β-нитей в кристаллической структуре I67-I70 (∼0.46 нм). Но ширина оси b в 2.91 нм предполагает в среднем 6 β-нитей на β-лист, что больше, чем в Ig доменах натурального титина (3–4 β-цепи на β-лист, средняя ширина 1.46 нм). Это значит, что некоторые кристаллы могут образовываться в результате упаковки парных Ig-подобных доменов, расположенных друг возле друга.

На следующем этапе исследования была проведена оценка механических свойств волокон, сделанных из синтезированного титина.


Изображение №3

Испытания на растяжение показали высокую прочность (378 ± 41 МПа), модуль Юнга / упругость (4.2 ± 0.6 ГПа), растяжимость (47 ± 7%) и ударную вязкость (130 ± 15 МДж/м³) (3a и 3b). Эти значения намного выше, чем у мышечных волокон или отдельных миофибрилл природного происхождения. Еще удивительнее то, что эти показатели превышают оные у многих жестких синтетических и природных материалов и намного превосходят показатели традиционных микробных материалов (3c).

СЭМ-изображения волокон после разрушения указывают на однородную, плотно упакованную микромасштабную морфологию. При этом волокна, сформованные идентичным образом из низкомолекулярного 4 Ig, показали значительно более низкую прочность (-60%), модуль упругости (-38%), деформацию на разрыв (-57%) и ударную вязкость (-85%) по сравнению с волокнами из сверхвысокомолекулярного полимерного волокна (3a и 3b).

Это наблюдение указывает на то, что столь впечатляющие показатели механических характеристик частично вызваны именно сверхвысокой молекулярной массой микробиологического полимера титина, что ранее достичь было невозможно. Однако, хоть это утверждение и не противоречит ранее установленным фактам, его необходимо было подтвердить на практике.

Чтобы получить материалы с точной молекулярной массой, были сконструированы гены, содержащие два и три повтора последовательности 4 Ig, обозначенные как 8 Ig и 12 Ig, соответственно. Затем эти белки были экспрессированы, очищены и превращены в волокна. Испытания этих волокон на растяжение выявили сильную положительную корреляцию между молекулярной массой и механическими свойствами.

Ученые отмечают, что волокна UHMW обладают гораздо большей прочностью и жесткостью (79% и 85% соответственно), чем волокна 12 Ig, при этом устраняются риски генетической нестабильности, которая в противном случае могла бы снизить выход биопродукции, что еще раз демонстрирует ценность полимеризации.

Внутри мышечных волокон природный белок титин ведет себя как эластичный материал при низком напряжении, способный к обратимой деформации без потери энергии. А при более высоком напряжении как материал, демпфирующий энергию, способный рассеивать ее для предотвращения повреждения миофибрилл из-за чрезмерного растяжения. Эта комбинация и переход между упругими состояниями и состояниями демпфирования энергии делает титин крайне важной составляющей скелетных и сердечных мышц. Следовательно, необходимо было установить, могут ли синтетические волокна повторить эти функции.

Было обнаружено, что при нагрузке на растяжение в 1.6% волокна могут быть упруго растянуты с относительно высокой упругостью и низкой демпфирующей способностью (17.9 ± 3.0%) и энергией демпфирования (0.1 ± 0.0 МДж/м³) (3d и 3e). Однако при нагрузке свыше 1.6% демпфирующая способность быстро увеличивается, достигая 81.3 ± 0.4% при 30% деформации (3d и 3е). Энергия демпфирования также быстро увеличивалась, достигая максимума в 53.3 ± 2.6 МДж/м³ при 30% деформации. Эта демпфирующая способность превосходит ту, что наблюдается для природного титина и даже для многих синтетических и натуральных материалов.

Во время релаксации естественной одиночной молекулы титина после сильного растяжения, развернутые домены Ig повторно складываются, обеспечивая форму самовосстановления и возврата к изначальным механическим свойствам. Чтобы проверить синтетические волокна на наличие таких свойств, были проведены опыты с повторяющимися циклами нагрузки-разгрузки.

После растяжения волокон до 30% деформации при относительной влажности в 45% и расслабления до 0% деформации наблюдалась остаточная деформация примерно при 20%. Это значит, что волокна могли быстро восстанавливать только около 33% общей деформации (цикл 1 на 3f).

Далее, чтобы лучше имитировать водную среду естественного титина в мышцах, растянутые волокна подвергали воздействию воздуха с высокой влажностью (95%) после релаксации. В результате волокна быстро сокращались до своей исходной длины. В этих условиях было установлено, что второй цикл нагрузки-разгрузки показал лишь небольшое снижение демпфирующей способности на 5% и уменьшение демпфирующей энергии на 15 МДж/м³ по сравнению с первым циклом (3f и 3g). Последующие циклы не привели к дальнейшему снижению демпфирующей способности, а лишь к снижению демпфирующей энергии на 3 МДж/м³ в течение последовательных 10 циклов.

Волокна, изготовленные из мономера титина, также продемонстрировали высокую демпфирующую способность (~ 60%) и восстановление, обусловленное влажностью, при растяжении почти до максимальной деформации (в данном случае 12%) в течение нескольких циклов. Несмотря на то, что энергия демпфирования мономерных волокон намного ниже (~ 4,7 МДж/м³) из-за различий в молекулярной массе, относительно высокая демпфирующая способность предполагает, что вызванное влажностью восстановление волокон может быть опосредовано повторной укладкой доменов Ig.

Следовательно, волокна титина, произведенные микробами, при обработке очень влажным воздухом могут быстро восстанавливать механические свойства, тем самым имитируя природный титин и мышечные волокна.

Чтобы выяснить возможные механизмы диссипации энергии, которые приводят к наблюдаемым механическим свойствам волокон из сверхвысокомолекулярного титина, было проведено моделирование молекулярной динамики (МД) для изучения поведения волокон титина при деформации растяжения.

Первоначальная молекулярная модель волокна была построена в соответствии с результатами структурного анализа, который показал, что пары Ig-подобных доменов из соседних полимерных цепей титина упакованы бок о бок и выровнены по одной оси. Затем к смоделированному волокну прикладывали одноосную растягивающую деформацию и измеряли кривую растягивающего напряжения-деформации.


Изображение №4

Полученные кривые хорошо согласовывались с экспериментальными результатами (4а), показывая начальную упругую деформацию примерно до 5% деформации с модулем упругости 3.6 ± 0.2 ГПа и последующим периодом пластической деформации и деформационного упрочнения с пиковым напряжением 378 ± 17 МПа. В то время как настоящие волокна демонстрировали внезапное разрушение при средней деформации в 47%, модель показала относительно постепенное снижение напряжения после 45%. Это различие может быть связано с эффектом небольшого объема моделирования по сравнению с экспериментальным образцом. В частности, в макромасштабных волокнах ожидается, что наличие дефектов и локализация деформации при текучести приведет к более внезапному разрушению, чем на молекулярном уровне.

Наблюдение за структурными и энергетическими изменениями в ходе моделирования свидетельствует о незначительных изменениях в структуре или относительном положении пар доменов Ig вплоть до деформации 10% (4b), при этом растягивающее напряжение равномерно распределялось по всей структуре (4c и 4d).

В последующем режиме пластической деформации и деформационного упрочнения (деформация 10–50%) соединительные области между доменами Ig становились полностью вытянутыми (4b), а напряжение накапливалось внутри Ig-подобных доменов (4c и 4d), нарушая внутрифибриллярные водородные связи и электростатические взаимодействия.

Стоит отметить, что во время этого режима общие межфибриллярные взаимодействия фактически увеличивались (4e), движимые усилением межфибрильных электростатических взаимодействий и межфибрильных водородных связей. Это говорит о том, что вытягивание волокна фактически вызывает отжиг межфибрильных пар Ig-подобных доменов, дополнительно укрепляя волокна.

Наконец, при высоких деформациях (50–80%) некоторые Ig-подобные домены претерпевали существенную развертку (4b и 4c) с серьезным разрывом внутрифибрильных водородных связей внутри этих доменов (красная линия на 4f). Любопытно, что развертка одних доменов Ig приводит к снижению напряжения в других доменах Ig, позволяя им расслабиться и восстановить некоторые стабилизирующие внутримолекулярные водородные связи.

В совокупности результаты моделирования предполагают, что превосходные механические свойства микробиологически продуцируемых сверхвысокомолекулярных волокон титина могут происходить из уникального межфибрильного спаривания свернутых Ig-подобных доменов.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В данном труде ученые описали метод синтеза волокон с помощью бактерией, которые по своим свойствам и характеристикам очень схожи с натуральными мышечными волокнами.

Полученные в ходе синтеза волокна оказались прочнее и эластичнее, чем натуральные мышцы, и даже превзошли по этим показателям многие синтетические и натуральные материалы, которые до этого считались лучшими.

Основная проблема, которую пришлось решить, заключалась в том, что бактерии были неспособны продуцировать белки больших размеров (грубо говоря). Посему ученые применили иной метод — они сделали бактерии, которые создавали и объединяли малые сегменты белка в полимеры со сверхвысокой молекулярной массой, в 50 раз превышающей массу бактериального белка. Полученный синтетический белок титин стал основой волокон, на производство 250 м которых нужен всего лишь 1 литр культуры.

По мнению ученых, полученные волокна могут послужить материалом для самых разных вещей, от одежды до бронежилетов, так как механические свойства созданного материала намного лучше тех, что сейчас применяются. Помимо этого, волокна могут найти свое применение и в биомедицинском направлении. Учитывая вполне вероятную биосовместимость разработанных волокон, они могут использоваться в тканевой инженерии, в разработки новых шовных материалов и т.д.

В будущем ученые намерены продолжить изучение свойств разработанного волокна и уделить внимание другим типам материалов, которые можно создать с помощью микробного синтеза.

Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?