У моей бабушки был весьма своеобразный метод проверки степени испорченности продуктов. Если наш кот не ел, что ему на «дегустацию» давала бабушка, значит этот продукт был испорчен и его нельзя было есть и нам. Не самый научный или надежный метод, но в нем все же есть определенная логика. Подобная логика касается и растений, которые способны реагировать на различные химические вещества в воде, почве или воздухе. Ученые из Калифорнийского университета в Риверсайде (США) решили превратить этот природный механизм в биодатчик токсинов, создав растение, которое становится ярко-красное в присутствии определенного токсина в поливе. Какой биологический процесс обеспечивает такую удивительную реакцию, как ученые ее запрограммировали на нужный им токсин, и где можно применить подобную разработку? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Определенная реакция организма на определенные молекулы не является чем-то необычным. Сложность заключается в достижении контроля, т. е. в получении нужной реакции на нужное химическое соединение. Как считают ученые, многие биологические части могут быть перепрограммированы для создания химически контролируемых функций, включая индуцированные лигандами* транскрипционные факторы* (например, lacI), рецепторы клеточной поверхности и их нижестоящие сигнальные компоненты (например, GPCR и DREADD, а также чувствительные к аналогам киназы) и системы химической индуцированной димеризации* (CID от chemical-induced dimerization) (например, рапамицин/FKBP/FRB). Из них CID особенно привлекателен, поскольку он предоставляет модульные части, которые можно использовать для конструирования химически регулируемой транскрипции*, активности ферментов, локализации белка, стабильности и других процессов.

Лиганд* — атом, ион или молекула, связанные с другим атомом (акцептором) с помощью донорно-акцепторного взаимодействия.

Транскрипционный фактор* — белок, который после его перемещения в ядро клетки регулирует транскрипцию, специфически взаимодействуя с ДНК, либо стехиометрически взаимодействуя с другим белком, который может образовывать специфичный к последовательности ДНК комплекс «белок-ДНК».

Димеризация* – реакция полимеризации, ведущая к образованию соединения с удвоенным химическим составом (димера).

Транскрипция* — построение РНК по комплементарной ей ДНК.

Первые описанные системы CID включают димеризующие лиганды микробного происхождения, такие как рапамицин, которые направляют неоассоциации белков, которые перестраивают передачу сигналов эукариотических клеток. Биологи, изучающие растения, впоследствии обнаружили, что многие фитогормоны* регулируют передачу сигналов посредством механизмов CID. Например, ауксин действует как молекулярный клей для стабилизации комплекса между убиквитинлигазой* SCFTIR1 и нижестоящими ко-репрессорами транскрипции AUX/IAA, что приводит к их убиквитилированию и деградации. Этот механизм также используется фитогормоном жасмоновой кислотой и аналогичен опосредованной талидомидом деградации транскрипционных факторов, которые лежат в основе противораковой активности иммуномодулирующих лигандов. В системах ауксина* и жасмоновой кислоты распознавание лигандов распределяется между партнерами по связыванию белков. Напротив, рецепторы АБК (абсцизовой кислоты; ABA от abscisic acid), гиббереллиновых кислот и стриголактонов* представляют собой аллостерические переключатели*, которые сначала связывают свои лиганды внутри карманов, исключенных из растворителя, а затем образуют комплексы с эффекторными белками. Несколько сенсоров растительных гормонов (например, АБК, ауксин и гибберелловая кислота) были использованы для разработки химически регулируемых процессов. Из них система восприятия АБК наиболее подробно охарактеризована на структурном и биохимическом уровнях.

Фитогормоны* — низкомолекулярные органические вещества, вырабатываемые растениями и выполняющие регуляторные функции.

Ауксины* — группа растительных гормонов, стимулирующих рост побегов и плодов растений, апикальное доминирование, фототропический рост (к свету), положительный геотропизм корней (рост вниз).

Убиквитинлигаза* — фермент-лигаза, ковалентно присоединяющий убиквитин к белку-мишени изопептидной связью. Убиквитинлигазы являются частью системы убиквитинопосредованного распада белка в протеасомах.

Стриголактоны* — группа гормонов растений, стимулирующих рост микоризных грибов, прорастание спор и порождает изменения, позволяющие грибу оплести корень растения и образовать микоризу.

Аллостерические модуляторы* — группа веществ, которые связываются с рецептором, чтобы изменить реакцию этого рецептора на стимул.

АБК — это гормон стресса, воспринимаемый растворимым рецептором PYR1 (кодируемым устойчивостью к пирабактину 1) и связанным с ним PYR1-подобным и регуляторным компонентом белков рецептора АБК (PYL/RCAR, для простоты PYLs). АБК связывается с рецепторами PYL и стабилизирует активированные конформеры, которые связывают и ингибируют протеинфосфатазы типа 2C (PP2C), что предотвращает дефосфорилирование и инактивацию PP2C их нижестоящих мишеней киназы SnRK2, активируемых стрессом. Сенсорный модуль АБК особенно эффективен для разработки биосенсоров.

Ранее ученые разработали несколько модулей CID, регулируемых агрохимикатами, включая PYR1^MANDI, предназначенные для обеспечения агрохимического контроля передачи АБК сигналов растений. Ученые также использовали компьютерный мутагенез для разработки PYR1 сенсоров для 21 структурно разнообразного каннабиноида и органофосфата. В других исследованиях было достигнуто успешное перепрограммирование другой PYL для распознавания 12 гербицидов. Таким образом, PYL имеют податливые, перепрограммируемые лиганд-связывающие карманы. Кроме того, в десятках исследований АБК датчик использовался для построения процессов, регулируемых АБК, у млекопитающих, дрожжей и бактерий. Следовательно, этот каркас уникален, поскольку он объединяет легко реконфигурируемый связывающий карман с автоматическим развертыванием в качестве химически индуцированного димеризатора.

Относительная простота разработки новых биосенсоров на основе PYR1 обусловлена двумя взаимосвязанными биохимическими свойствами: аффинной амплификацией и димеризацией. Фосфатаза-партнер PYR1 действует аналогично корецептору, повышая очевидную аффинность связывания лиганда примерно в 100 раз. Это делает распознавание лиганда относительно легким для перепрограммирования, поскольку нескольких мутаций достаточно для новых специфичностей связывания. Поскольку распознавание лиганда можно изменить, не нарушая интерфейс димера, аффинная амплификация не зависит от лиганда и требует только лиганда для стабилизации активированного конформера PYR1.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые использовали эту модульность для перепроектирования интерфейса димера PYR1/HAB1 для создания новой ортогональной «*» системы CID. Было показано, что есть возможность перепрограммировать распознавание лиганда ортогонального модуля и использовать его с модулем дикого типа (WT от wild-type) для создания двухканального контроля транскрипционных выходов Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). В результате ученые создали растения арабидопсиса, которые визуально сообщают о наличии наномолекулярных уровней азинфос-этила и диазинона, двух запрещенных фосфорорганических агрохимикатов.

Результаты исследования

Изображение №1

Ученые использовали системы выбора на основе Y2H* для создания регулируемого АБК модуля CID PYR1/HAB1, который функционирует ортогонально датчику дикого типа. Для этого ученые определили большой набор мутантных аллелей* интерфейса димеров, которые нарушают взаимодействия, стимулируемые АБК. Затем был использован функциональный отбор для идентификации взаимосупрессивных комбинаций аллелей, которые восстанавливают индуцированную АБК димеризацию (1a). Чтобы систематически определить эти мутации, была проверена ранее созданная индексированная библиотека из 399 членов PYR1, которая содержит насыщающие мутации в 21 остатке на интерфейсе связывания HAB1. Аналогичным образом была создана коллекция из 266 насыщающих мутаций HAB1, нацеленных на 14 остатков, связывающих PYR1. Каждый мутант был протестирован на стимулируемую АБК димеризацию со своим партнером дикого типа по связыванию с использованием анализов Y2H, которые выявили 236 и 163 мутации, которые нарушают индуцированную АБК димеризацию в PYR1 и HAB1 соответственно.

Y2H* (двугибридный анализ) — молекулярно-биологический метод, позволяющий с высокой точностью детектировать белок-белковые и ДНК-белковые взаимодействия в условиях in vivo.

Аллели* — различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом, определяют направление развития конкретного признака.

Эти коллекции «мертвых» аллелей были котрансформированы в обратный двухгибридный штамм S. cerevisiae, а отбор на основе роста использовался для отбора мутантных комбинаций, восстанавливающих димеризацию, индуцированную АБК. В результате было выявлено девять пар взаимосупрессивных комбинаций аллелей, лучшей из которых была PYR1^T162D/HAB1^V393R (1b).

У наземных растений, где первоначально был обнаружен АБК-чувствительный модуль CID PYR1/HAB1, активация эндогенной передачи сигналов требует рецептор-опосредованного ингибирования фосфатазы, что приводит к активации нижестоящих киназ SnRK2, активируемых стрессом. Чтобы исследовать ортогональность PYR1^T162D/HAB1^V393R с помощью биохимического анализа, ученые провели анализы фосфатазы in vitro («в стекле», т. е. в искусственных условиях) с использованием рекомбинантных белков и заметили, что PYR1^T162D не сильно регулирует активность HAB1, что согласуется с его поведением в анализах Y2H (1c).

Кроме того, было установлено, что PYR1^T162D не регулирует активность HAB1^V393R, несмотря на его способность связывать HAB1^V393R в анализах Y2H. Это означает, что АБК-активируемый конформер PYR1^T162D не способен блокировать доступ субстрата к каталитическому карману HAB1^V393R.


Изображение №2

Чтобы определить, можно ли перепрограммировать распознавание лиганда ортогонального модуля, ученые «привили» мутации T162D/V393R к ранее сконструированным рецепторам PYR1^MANDI и HAB1 (2a). Было проведено тестирование PYR1^MANDI,T162D на предмет его взаимодействия с HAB1^V393R и HAB1^V393R,R505A (R505A блокирует взаимодействие с киназами, регулируемыми PP2C, и был введен для уменьшения перекрестных помех АБК).

Затем был использован мутагенез и селекция, чтобы улучшить MANDI чувствительность PYR1^MANDI,T162D (2a). Первичные скрининги показали, что чувствительность может быть повышена за счет С-концевых мутаций M158 и A160, которые находятся рядом с ортогонализующими мутациями T162D и сенсибилизирующими MANDI мутациями F159L, обе расположен в C-концевой α-спирали PYR1. На основании этого было предположено, что мутации T162D/F159L снижают MANDI чувствительность за счет изменения локальной структуры C-концевой α-спирали PYR1, которая участвует в индуцированных лигандом конформационных изменениях и расположена для контакта с объемной ортогонализующей мутацией HAB1^V393R. Поэтому ученые мутагенизировали M158, F159 и A160 в C-концевой α-спирали и идентифицировали мутации в этих остатках, которые повышают чувствительность модуля, используя отбор на основе Y2H, давая недвойственный мутант PYR1*^MANDI (PYR1^{Y58H;K59R;V81I;F108A;S122G;M158I;F159V;A160V;T162D}). Дополнительный мутагенез HAB1^{V393R,R505A,D204A} с последующим положительным отбором привел к образованию каталитически неактивного пятикратного мутанта, который был назван HAB1* (HAB1^{R199A;D204A;S322D;V393R;R505A}).

Конечный модуль PYR1*^MANDI/HAB1* CID реагирует на низкие нМ концентрации MANDI в анализах Y2H, избирательно связывается с HAB1* и не сильно регулирует фосфатазную активность WT HAB1, что в совокупности указывает на чувствительную и ортогональную функцию конечного модуля PYR1*^MANDI/HAB1* CID (2b, 2c).

Обширный мутагенез, необходимый для создания высокочувствительной MANDI реакции, побудил ученых получить рентгеновскую кристаллическую структуру тройного комплекса PYR1*^MANDI/mandi/HAB1*. Как и ожидалось, контакты лиганд-рецептор отражают контакты исходного PYR1^MANDI, а модуль практически совместим с модулями WT. Карта электронной плотности подтверждает отсутствие ионов металлов в каталитическом сайте HAB1. В структуре обнаруживаются последствия ортогональных мутаций T162D/V393R, которые образуют солевой мостик*, расположенный на расстоянии 2.7 Å друг от друга (2d). Таким образом, мутационный конвейер создал ортогональный сигнальный модуль, введя соляной мост в интерфейс связывания PYR1*^MANDI/HAB1* с минимальными изменениями в глобальной структуре модуля.

Солевой мостик* (солевой связи) в биохимии белков — относительно слабая ионная связь между положительно и отрицательно заряженными боковыми цепями аминокислот белка, предающая стабильности структуре белков.

Изображение №3

Затем необходимо было установить, можно ли сконструировать связывающий карман PYR1*^MANDI для связывания новых лигандов аналогично рецептору дикого типа. Для этого использовался NNK мутагенез*, необходимый для создания библиотеки односайтового насыщенного мутагенеза PYR1*^MANDI, нацеленной на всю кодирующую последовательность, что позволяет идентифицировать как контактирующие с лигандом, так и проксимальные остатки, которые модулируют связывание лиганда. Полученную библиотеку подвергали скринингу по панели из 10 органофосфатных лигандов, чтобы получить рецепторы, реагирующие на шесть из 10 протестированных органофосфатных лигандов (3a, 3b).

Мутагенез* — процесс изменения в нуклеотидной последовательности ДНК, приводящий к мутациям.

Азинфос-этиловый рецептор был выбран для созревания аффинности* и подвергнут двум раундам мутагенеза на основе рекомбинации и селекции с получением пятикратного мутанта (PYR1*^{MANDI, N15E, V83W, I110Y, V164Y, V190Y}; PYR1*^AZIN), который реагирует на нМ концентрации азинфос-этила в Y2H анализах (3c). PYR1*^AZIN дополнительно сохраняет строгую ортогональность и не взаимодействует с HAB1 дикого типа (3d).

Аффинность* — термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия атомов или молекул веществ, способных образовать химические соединения.

Изображение №4

Чтобы установить, можно ли использовать модули ортогонального * ответа для транскрипционных ответов с несколькими входами и выходами in vivo, ученые разработали и протестировали схемы, управляемые WT и * модулями, как у S. cerevisiae, так и у Arabidopsis thaliana.

В дрожжах ученые обеспечили двухконтурный контроль, используя домен цинкового пальца* Z4 и белок-репрессор макролидов из E. coli (далее по тексту — EP), чтобы управлять экспрессией двух отдельных репортерных генов*. Схемы были построены путем слияния EP с PYR1 и Z4 с PYR1*^MANDI или PYR1*^AZIN и домена активации транскрипции VP64 с HAB1 и HAB1* (4a). Используя модули дикого типа и PYR1*^MANDI, удалось создать набор схем, которые реагируют на АБК и MANDI с нМ-чувствительностью и незначительными перекрестными помехами (4b).

Цинковый палец* — небольшой структурный мотив белка, стабилизированный одним или двумя ионами цинка, связанными координационными связями с аминокислотными остатками в составе белка.

Репортерные гены* — гены, которые присоединяют к регуляторным последовательностям других генов для исследования проявлений генов в культурах клеток.

Замена PYR1 на PYR1^DIAZI (диазинонечувствительный рецептор) и PYR1*^MANDI на PYR1*^AZIN привела к образованию единственного штамма дрожжей, который реагировал на один или оба из этих фосфорорганических пестицидов с низкими нМ значениями полумаксимальной эффективной концентрации (EC50*) и большим динамическим диапазоном (4c, 4d). Учитывая большое количество органофосфатов, которые могут воспринимать каркасы PYR1 и PYR1*, это открывает возможность создания мультисенсорных штаммов, которые могут сообщать о наличии и концентрации этих загрязнителей окружающей среды.

EC50* (полумаксимальная эффективная концентрация) — концентрация лиганда, которая вызывает эффект, равный половине максимального возможного для данного лиганда после истечения некоторого промежутка времени.

Изображение №5

Как отмечают ученые, разработка лиганд-регулируемых цепей для синтетической биологии растений ограничена относительно небольшим количеством частей, доступных для построения генетических цепей. Описываемый в труде * модуль может решить эту проблему, однако его полезность требует строгой изоляции * компонентов от эндогенного сигнального механизма АБК. Поскольку передача сигналов АБК имеет множество физиологических эффектов, таких как ингибирование прорастания семян и запуск закрытия замыкающих клеток, перекрестная активация *-модуль может вызывать многочисленные нежелательные фенотипы, связанные с АБК.

Разработанный модуль включает в себя несколько мутаций для ограничения перекрестных помех. Во-первых, ортогонализирующие мутации T162D/V393R уменьшают взаимодействия * и WT. Во-вторых, каталитическая инактивация HAB1* мутацией D204A предотвращает дефосфорилирование киназ SnRK2 и блокирование передачи сигналов АБК. В-третьих, HAB1* содержит две мутации (R505A и V393R), которые нарушают его способность связывать SnRK2. Наконец, PYR1*^MANDI не активируется АБК из-за нескольких мутаций в его связывающем кармане (2b, 2c).

Ученые создали и протестировали трансгенные растения 35S::GFP-PYR1*^MANDI и 35S::GFP-HAB1* для исследования потенциальных перекрестных помех. Всхожесть семян и температура листьев (которые повышаются из-за закрытия замыкающих клеток) растений 35S::GFP-PYR1*^MANDI аналогичны таковым у растений дикого типа после обработки АБК или MANDI, в отличие от ранее сконструированного положительного контроля 35S::PYR1^MANDI. Температура и морфология листьев линий 35S::GFP-HAB1* были также аналогичны растению дикого типа, в отличие от нечувствительного к АБК мутанта (abi1-1) положительного контроля. В совокупности эти наблюдения указывают на незначительное перекрестное взаимодействие путей АБК со стороны компонентов * модуля.

Для дальнейшего изучения пригодности * модуля для синтетической биологии ученые использовали разработанные ими варианты PYR1 и PYR1*/HAB1* для создания трансгенных растений, в которых диазинон и азинфос-этил регулировали разные результаты.

Ученые создали две независимые трансгенные линии с одной вставкой 35S::GFP-PYR1^DIAZI. Наблюдалось индуцированное диазиноном повышение температуры листьев (5a) и ингибирование роста.

Чтобы проверить модуль «*», ученые сконструировали несколько трансгенных линий, в которых конструкции на основе GAL4_DBDPYR1*^AZIN/VP64-HAB1* управляют экспрессией гена биосинтеза синтетического пигмента беталаина RUBY или EGFP. Эти линии показали заметные изменения в пигментации или экспрессии GFP после воздействия низких концентраций азинфос-этила при внекорневой подкормке растений (5b). Также была создана версия этой системы, контролируемая E-белком (EP_DBDPYR1*^AZIN/VP64-HAB1*). Аналогичным образом наблюдалась индукция RUBY у четырех из пяти первичных трансгенных растений после воздействия 1 мкМ азинфос-этила.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые успешно создали растение, способное менять свой цвет на ярко-красный в ответ на токсин под названием азинфос-этил.

Подобные реакции и так происходят в растениях и других организмах, но они обычно приводят к печальным последствиям. Ученым же необходимо было разработать методику, посредством которой растение будет реагировать на токсин, но его жизнедеятельность при этом будет продолжаться в штатном режиме.

Фундаментом успешной реализации данной затеи стал белок под названием абсцизовая кислота (АБК), который помогает растениям адаптироваться к стрессовым изменениям окружающей среды. Во время засухи растения выделяют АБК, а белки-рецепторы распознают АБК и реагируют на увеличение его концентрации. В результате это приводит к закрытию пор на листьях для снижения испаряющейся из них влаги.

Ученые установили, что рецепторы АБК можно запрограммировать связываться с другими химическими веществами, кроме АБК. В результате было получено растение, которое в ответ на данное вещество меняет свой цвет. В опытах роль экспериментального вещества выступил пестицид азинфос-этил, который запрещен во многих странах ввиду своей высокой токсичности. Но растения не стали единственными испытуемыми, так как ученым удалось достичь аналогичного результата и с дрожжами. Главным отличием модифицированных дрожжей от растений стала их возможность реагировать на несколько веществ одновременно, чего пока растения не могут.

В будущем ученые намерены продолжить работу над совершенствованием системы. По их словам, главной целью является создание универсального датчика, способного одновременно реагировать на множество химических веществ.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?