Изучение человека в настоящее время проводится множеством разных наук известными и новыми методами и весьма интенсивно. В мире осуществляются многомиллиардные исследовательские проекты. Изучаются геном, протеом, транскриптом человека, мозг человека и другие составляющие организма. Люди поняли, что пришло время серьезно взяться за изучение самих себя, своего организма, состоящего из триллионов взаимосвязанных клеток. Сложность организма, обеспечивается, однако, не только наличием большого количества выполняющих разные функции клеток, но также их взаимодействием на уровне межклеточной среды, тканей и даже целых органов.
В рамках проекта Атлас клеток человека (Human Cell Atlas) создан такой атлас и уже используется. Он включил данные, полученные сразу несколькими международными исследовательскими коллективами. Развитие современных технологий секвенирования РНК отдельных клеток (scRNA-seg) показало, что типы клеток человеческого организма очень многообразны, сейчас насчитываются сотни различных типов. В предлагаемой работе приводится характеристика транскриптома, в рамках которого осуществляется картирование клеток, его структура и динамичность.
Транскриптом называют молекулу РНК, образующуюся в результате транскрипции (экспрессии соответствующего гена или участка ДНК). Примерами транскриптов являются: матричные РНК (мРНК). В статье приводится характеристика транскриптома, его структура и динамичность. Методы исследования транскриптов. Кодирующие и некодирующие РНК, их классификация, микро РНК, siРНК, нано-РНК, сборка транскриптов кратко рассматриваются в публикации.
Цель публикации в первую очередь образовательная, познавательная, популяризация науки, а также стремление привлечь в ряды исследователей, в науку приток новых молодых умов, вызвать в таких умах стремление к поиску ответов на возникающие вопросы. Масштабность темы требует ввести разумные ограничения на излагаемый материал после краткого панорамного ее рассмотрения.
Введение
Общая схема, показывающая взаимосвязи генома, транскриптома, протеома и метаболома (липидома, гликома).
После определенных успехов и наведения некоторого порядка в геноме, протеоме пришла пора взяться за транскриптом и метаболом. Огромный массив клеток человеческого организма оказался практически неосвещенным наукой, атласы клеток не существовали. Даже на вопрос о количестве типов клеток ответа не было. Основу клеточной (цитологической) диагностики составляет изучение клеток, их типов, изменений их распределения по органам, расположения, взаимодействия и строения.
Конечной целью изучения генома конкретного организма является интеграция его генетических, цитогенетических и физических карт, а также их привязка к полной геномной последовательности.
Также картирование генома возможно с помощью биоинформатических методов. Для этого сначала проводят секвенирование генома, полученные риды выравнивают, получают контиги и скаффолды, которые затем картируют на геном специальными программами картировщиками.
Критерии цитологической диагностики включают анализ клеточного и неклеточного состава организмов: количество клеток, наличие клеток разного типа, их расположение в структурах или разрозненно, вид структур, размер, форма, строение клеток и ядер, наличие или отсутствие клеточного и ядерного полиморфизма и другие параметры.
По характеру и степени выраженности отклонения от нормального клеточного состава судят о природе патологического процесса. По признакам, характерным для определенных тканей, судят о тканевой принадлежности опухоли. При этом учитывают фон препарата — элементы крови, бесструктурное вещество, коллоид, жир и др.
Следующим шагом является изучение метаболома и разработка теории метаболомики.
Метаболом может быть определен как полный набор низкомолекулярных метаболитов в организме и включает разные классы химических веществ
Основные понятия и термины
Каждая клетка человеческого мозга содержит одну и ту же последовательность ДНК, но в разных типах клеток разные гены копируются на нити РНК для использования в качестве белковых программ. Именно из-за разнообразия белков так много типов клеток в организме и в мозге, что и делает столь сложным наш мозг. Раскроем некоторые важные для восприятия контекста термины и понятия.
Транскрипт — молекула РНК, образующаяся в результате транскрипции (экспрессии соответствующего гена или участка ДНК).Примерами транскриптов являются: мРНК, рРНК,тРНК, малые РНК.
Транскрипто́м (англ. transcriptome) — совокупность всех транскриптов, синтезируемых одной клеткой или группой клеток, включая мРНК и некодирующие РНК. Понятие «транскриптом» может обозначать полный набор транскриптов в данном организме или специфический набор транскриптов (молекул РНК), представленный в клетках определённого типа. Транскриптом может сильно меняться в зависимости от условий окружающей среды. Он включает в себя все транскрипты данной клетки, а также отражает профиль экспрессии генов в данный момент времени.
Транскриптомика — это технология, в которой выполняется идентификация всех матричных РНК, кодирующих белки, определение количества каждой индивидуальной мРНК, определение закономерностей экспрессии всех генов, кодирующих белки.
Пространственная транскриптомика — это технология, которая позволяет исследователям наблюдать (и соблюдать) закономерности экспрессии генов в тканях, сохраняя при этом их пространственный контекст. Одной из мощных платформ в этой области является 10x Genomics Visium в соединении с секвенированием Illumina. Ее основные положения иллюстрируются рисунками ниже
Разработан метод пространственной транскриптомики, позволяющий анализировать индивидуальные клетки в срезах тканей. Метод включает в себя приготовление среза тканей, окрашивание, распознавание индивидуальных клеток при помощи искусственного интеллекта, автоматическую микродиссекцию клеток лазером, экстракцию белков и анализ образцов при помощи масс-спектрометрии, включает в себя каталогизацию всех РНК в отдельных клетках. Результаты анализа затем можно наложить на изображение среза ткани, таким образом выделив пространственные различия в транскриптомных профилях.
Сплайсинг (от англ. splice — сращивать или склеивать концы чего-либо) — процесс вырезания определённых нуклеотидных последовательностей из молекул РНК и соединения последовательностей, сохраняющихся в «зрелой» молекуле, в ходе процессинга РНК.
Секвени́рование РНК (англ. RNA sequencing, RNA-seq) — метод определения первичной структуры молекул РНК, представляющий собой высокочувствительный и точный инструмент для изучения транскриптома. Под этим может подразумеваться как секвенирование мРНК, так и определение последовательности некодирующих РНК. Современное полногеномное секвенирование основано на прямом секвенировании фрагментов кДНК.
Экспрессия генов — процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Некоторые этапы экспрессии генов могут регулироваться: это транскрипция, трансляция, сплайсинг РНК и стадия посттрансляционных модификаций белков. Процесс активации экспрессии генов короткими двухцепочечными РНК называется активацией РНК.
Способами определения экспрессии генов в данное время являются секвенирование РНК, содержащих поли-А хвост (мРНК), а также применение экспрессионных ДНК-микрочипов. Секвенирование РНК становится всё более распространённым методом в связи с усовершенствованием методов секвенирования нового поколения. Секвенирование РНК не только позволяет определить уровень экспрессии каждого белоккодирующего гена в геноме, но и различать варианты мРНК, получающиеся в результате альтернативного сплайсинга.
Транскрипто́мные техноло́гии (англ. transcriptomics technologies) — методы, разработанные для изучения транскриптома (то есть совокупности всех РНК-транскриптов) организма. В состав транскриптома входят все транскрипты, которые присутствовали в клетке на момент выделения РНК. Исследуя транскриптом, можно установить, какие клеточные процессы были активны в тот или иной момент времени.
В транскриптомике есть два основополагающих метода: микрочипы, позволяющие выявить наличие и количество определённых транскриптов, и секвенирование РНК (РНК-Seq), в котором используются методы секвенирования нового поколения для получения последовательностей всех транскриптов. Тип клеток в мозге мыши определяется с помощью метилирования: на основе химических маркеров — «штрих-кодов» — расставленных вдоль ДНК, которые определяют, когда гены включаются или выключаются.
Транскриптомные базы данных постоянно растут и становятся всё более полезными для исследователей. Это связано с тем, что правильная интерпретация данных, полученных в ходе транскриптомного эксперимента, практически невозможна без опоры на предшествующие исследования.
Хронология
1970 Библиотеки РНК, кот. конвертированы в комплементарную ДНК (для бабочки)
1979 Коллекция библиотеки кДНК для мРНК шелкопряда
1980 Получены транскрипты (метод обрыва цепи по Сенгеру) чтением пар оснований(п.о.)
1990 Транскриптомика становится биологической наукой
1991 Получена последовательность 609 мРНК из мозга человека
1995 1-й транскриптомный метод, осн..на секвенировании, сериальный анализ экспрессии генов
1997 Первое исследование, где описано 60633 транскрипта, экспрессируемых у S.serevisiae
1998 Введен термин метаболом, придуманный для соответствия существующим терминам
2003 Вышла из печати книга по метаболомике
2005 Технология секвенирования с длиной прочтения 0,7 млрд п.о. (платформа 454 Life Sciences)
2006 Технология секвенирования длина прочтения 50-300 п.о.900 млрд п.о. (платформа Illumina)
2008 Получены 2человеческих транскриптома из миллионов последовательностей от 16 тыс генов
2008 Технология секвенирования с длиной прочтения 50 п.о. 320 млрд п.о. (платформа SOLID)
2010 Технология секвенирования с длиной прочтения 400 п.о. 30 млрд п.о. (платформа Ion Torrent)
2011 Технология секвенирования с длиной прочтения 104 п.о.320 млрд п.о. (платформа Pac Bio)
2015 Прост. процедурой получаются транскриптомы людей с разл. заболеваниями тканей (клеток)
2016 Запуски РНК-Seg, размещенные в базе NCBI SRA
2017 Запущена Сеть переписи клеток (BICCN)– консорциум центров США и Европы
2019 Секвенировали РНК из кожи, хрящей, печени и мышц щенка Тумата возрастом 14300 лет.
2021 В Интернете опубликован Атлас метаболома мыши на разных этапах ее жизни.
Задача картирования типов клеток
Основу цитологической диагностики организмов составляет изучение клеток, изменений в их расположении и строении. Критерии такой диагностики включают анализ клеточного и неклеточного состава: количество клеток, наличие клеток разного типа, их расположение в структурах или разрозненно, вид структур, размер, форма, строение клеток и ядер, наличие или отсутствие клеточного и ядерного полиморфизма и другие параметры.
По характеру и степени выраженности отклонения от нормального клеточного состава судят о природе патологического процесса. По признакам, характерным для определенных тканей, судят о тканевой принадлежности опухоли. При этом учитывают фон препарата — элементы крови, бесструктурное вещество, коллоид, жир и др.
Задача картирования типов клеток в тканях представляет интерес как с позиций фундаментальной науки, так и для медицины. Новейшие технологии пространственной транскриптомики помогают ее решить: клетки разного типа синтезируют различный набор РНК (транскриптом) и белков (протеом), что позволяет отличить их друг от друга.
Принцип 10х Genomics Visium заключается в специальном чипе. Захваченные молекулы РНК из ткани затем помечаются современными молекулярными идентификаторами (UMI) во время процесса обратной транскрипции. Сочетание образцов с пространственным штрих-кодом и UMI обеспечивает точность и специфичность генерируемых данных.
Используя этот запрос пространственной транскриптомики, исследователи могут получить более глубокое понимание пространственной организации клеток. и сложные молекулярные взаимодействия, происходящие внутри тканей, бесценную теорию о механизмах, конференции на основе биологических процессов в различных областях, включая онкологию, нейробиологию, биологию развития, иммунологию. и ботанические исследования.
В образце ткани выделялись участки для анализа, по результатам которого определялся состав РНК в каждом. Предполагалось, что это позволит определять клетки какого типа размещены в том или ином участке. Как всегда, не удалось избежать сложностей.
Во-первых, в ткани может быть множество, мало отличающихся по составу РНК, типов клеток, например, стромального происхождения, что существенно усложняет их идентификацию.
Во-вторых, размер исследуемых участков ткани, обычно оказывается значительно больше среднего размера клеток, в результате чего в каждый попадает смесь РНК из различных типов, что затрудняет последующую обработку.
Учитывая названные ограничения, нельзя обойтись при обработке только ручным трудом исследователей – необходимы масштабируемые вычислительные методы. Международная группа, в состав которой вошел представитель РФ, разработала инструмент cell2location, который выявляет пространственное распределение типов клеток на основе данных секвенирования отдельных клеток в пространственной транскриптомике.
Система сравнивает количество РНК в пространственных данных с эталонными профилями экспрессии РНК для присутствующих в ткани типов клеток, определяя точное количество разных клеток в каждом из экспериментально изученных участков. Инструмент сell2location эффективно корректирует различные источники экспериментальных погрешностей, что позволяет интегрировать клеточную и пространственную транскриптомику с более высокой чувствительностью, чем существующие инструменты. Этот инструмент универсален и позволяет находить редкие типы клеток, которые невозможно обнаружить традиционными для гистологии методами.
В рамках проекта ученые опубликовали 21 новую статью в трех журналах: Science, Science Advances и Science Translational Medicine.
Эра клеточных исследований человеческого мозга стучится в нашу дверь!
Проект Исследования мозга посредством развития инновационных нейротехнологий (Brain Research through Advancing Innovative Neurotechnologies (BICCN)). Его запустили в 2017. В октябре 2021 года Сеть переписи клеток инициативы BRAIN Initiative (BICCN) завершила первую фазу долгосрочного проекта по созданию атласа всего мозга мыши (млекопитающего), включающего 17 исследований, включая атлас и перепись типов клеток в первичной моторной коре.
Данные, инструменты и знания для типов клеток
Ниже показаны проекты по генерированию данных, связанные с BICCN, и их методы профилирования конкретных типов ячеек. Заполненные ячейки указывают на продолжающееся и запланированное получение данных у мышей, приматов, не являющихся человеком, и человека. Более подробная информация по каждому проекту доступна на страницах команды портала.
Роль BCDC заключается в обеспечении публичного доступа и организации сложных данных, инструментов и знаний, полученных BICCN. Портал BICCN служит отправной точкой для деятельности BICCN и обеспечивает доступ к наборам данных BICCN, хранящимся в архивах данных R24. По мере того, как будут раскрыты наши знания о взаимосвязи модальностей данных BICCN, будут представлены сводные знания о типах клеток, которые помогут улучшить наше понимание роли типов клеток в мозге.
Все данные BICCN, соответствующие принятым стандартам контроля качества, немедленно доступны общественности через несколько архивов данных R24 и доступны через этот сайт. Архивы данных BICCN включают:
Транскриптомные и эпигеномные данные доступны в Neuroscience Multi-Omic (NeMo) Archive , хранилище данных, ориентированном на хранение и распространение -омных данных, полученных в рамках инициативы BRAIN и связанных с ней проектов исследования мозга.
Наборы данных модальности изображений доступны через Библиотеку изображений мозга (BIL) , общедоступный ресурс, позволяющий исследователям хранить, анализировать, извлекать, делиться и взаимодействовать с большими наборами данных изображений мозга.
Данные нейрофизиологии доступны на сайте DANDI: Распределенные архивы для интеграции нейрофизиологических данных.
Данные электронной микроскопии и рентгеновской микротомографии доступны в Brain Observatory and Storage Service (BossDB).
Особый интерес сейчас представляет использование современных инструментов:
структурной и функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ),
диффузионной МРТ,
магнитоэнцефалографии (МЭГ),
электроэнцефалографии (ЭЭГ),
позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ),
спектроскопия в ближней инфракрасной области (NIRS)
и другие не инвазивные методы сканирования для отображения анатомии,
физиологии, перфузии, функции и фенотипов человеческого мозга.
Данные собирались в архивах сетью переписи клеток (BICCN) и они позволяют исследователям заняться фундаментальными научными вопросами о человеческом мозге и его генетической организации. Основная задача BICCN– получение характеристик типов клеток и их функций в мозге человека, приматов (NHP) и грызунов.
Используя самые передовые технологии, которые до сих пор в основном применялись только к животным изучается клеточный состав взрослого и развивающегося человеческого мозга на транскрипционном, эпигенетическом и функциональном уровнях.
Исследования организованы в рамках пяти основных тем:
(i) атлас отдельных клеток взрослого человека, включая исследования с использованием транскриптомного и эпигеномного анализа отдельных клеток для характеристики человеческого мозга;
(ii) атлас отдельных клеток приматов (NHP) взрослых, который фокусируется на аналогичном анализе отдельных клеток в мозге мартышек и макак;
(iii) сравнительный анализ отдельных клеток, который сравнивает клеточный состав мозга человека и мозга NHP;
(iv) одноклеточный анализ развития мозга человека и NHP, направленный на характеристику динамики развития мозга человека и NHP;
(v) функциональный и анатомический анализ и моделирование типов нейрональных клеток человека, которое включает физиологическую и анатомическую характеристику клеточных свойств в живых тканях человека, а также моделирование типов клеток и специализированных клеточных свойств у людей по сравнению с моделями на грызунах.
Благодаря более тонким техникам стало возможно увидеть то, какие гены активны в разных клетках мозга важнейшего органа человека и животных, то есть, развивая мысль о детализации исследования становится возможным понять и оценить разнообразие и сложные взаимосвязи клеток.
Особенности любой ткани в организме определяются ее клетками, а их специфика тем, какие гены активны в их ДНК. Как все выглядит на самом деле до настоящего времени неизвестно. О том, как клетки общаются между собой мало что известно.
Ученые использовали также другую методику, которая анализировала трехмерную структуру молекул ДНК в каждой клетке, чтобы получить дополнительную информацию о том, какие последовательности ДНК активно используются. Информация взята с портала «Научная Россия» (https://scientificrussia.ru/)
В эксперименте на мышах изучались более 3 тысяч клеток головного мозга. Головной мозг мышей состоит примерно из 100 млн клеток. Каждая нервная клетка в диаметре примерно равна 20 мкм, а глиальная — 10 мкм. Для каждой клетки определялось какой из 20 тыс. генов был активен. Все клетки мозга мышей разделились на 47 видов: специализированные нейроны, клетки кровеносных сосудов и вспомогательные клетки нервной ткани, называемые глиальными. Они обеспечивают удаление отходов жизнедеятельности клеток, защиту от инфекций и поставку питательных веществ.
Созданная карта мозга позволила ученым определить неизвестные до сих пор типы клеток, например, шесть различных типов олигодендроцитов — клеток, которые образуют электроизоляционную миелиновую оболочку вокруг нервных клеток.
Подробная карта клеток мозга мышей, показывает, какие гены обеспечивают появление отдельных типов клеток. Это дает науке ключ для разработки методов эффективной диагностики и лечения многих нервных заболеваний, например, таких как рассеянный склероз
Заключение
Что происходит с наукой о человеке? Человек как объект природы изучается многими науками и в некоторых из наук получены впечатляющие результаты. В целом же можно сказать, что очень мало наука знает о человеке. Наиболее интенсивно внедряется в область человекознания биология. Но объект так сложен, что даже принципы возникновения, эволюции, развития и функционирования, осознаваемого поведения до конца не ясны.
Создание атласов и картирование клеток реально оказывают положительное влияние на ход исследований живых организмов и мозга, так как клетка лежит в основании жизни и возможно разума.
Литература
Молино Б.Дж., Арлотта П., Менезес Дж.Р., Маклис Дж.Д., Спецификация подтипа нейронов в коре головного мозга. Нат. Преподобный Нейроски. 8 , 427–437 (2007).
Клаусбергер Т., Сомоджи П., Разнообразие нейронов и временная динамика: единство операций гиппокампа. Наука 321 , 53–57 (2008).
Сугино К., Хемпель С.М., Миллер М.Н., Хэттокс А.М., Шапиро П., Ву К., Хуанг З.Дж., Нельсон С.Б., Молекулярная таксономия основных классов нейронов в переднем мозге взрослой мыши. Нат. Неврология. 9 , 99–107 (2006).