Одной из самых острых проблем современности является экологическая картина мира, а точнее влияние на нее деятельности человека. В связи с этим проводится множество исследований, нацеленных на поиск экологичных альтернатив классическим источникам энергии и материалам. Замена пластиков на более экологичные и биоразлагаемые материалы является важной, но не единственным направлением в этой сфере. Сюда также можно отнести и труды, изучающие альтернативы классическому текстилю. Ученые из Имперского колледжа Лондона (Великобритания) создали новый тип экокожи, выращиваемый с помощью бактерий и наделенный способностью к самоокрашиванию. Как именно происходит процесс выращивания этого материала и каковы его физико-химические характеристики? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Текстильная и кожевенная промышленности, как и многие другие, оказывают негативное воздействие на окружающую среду: выбросы парниковых газов в результате сельскохозяйственного производства и промышленной переработки, загрязнение воды в результате дубления и крашения, загрязнение микропластиком из-за распада синтетических волокон и т. д. Дабы улучшить ситуацию проводятся поиски новых устойчивых биоматериалов, к которым относится и кожа, созданная на основе мицелия и растительных волокон. Эти усилия являются успешным результатом сочетания биологического производства с инженерной и химической обработкой для переработки этих природных биоматериалов в альтернативный текстиль. Однако отрасли еще предстоит использовать генную инженерию этих организмов, производящих материалы, чтобы воспользоваться преимуществами устойчивых методов, используемых биологическими системами для улучшения физических и эстетических свойств биоматериалов.

В области инженерии живых материалов (ELM от engineered living materials) используются инструменты синтетической биологии для перепрограммирования живых клеток на уровне ДНК для создания новых или улучшенных биоматериалов для конкретных применений. Бактериальная целлюлоза (BC от bacterial cellulose) является перспективным природным биоматериалом, наиболее эффективно продуцируемым бактериями грамотрицательного рода Komagataeibacter. В богатой углеродом среде эти бактерии полимеризуются и выделяют линейные цепи глюкозы. Эти цепи затем самособираются в плотную взаимосвязанную сеть из целлюлозных волокон. Эта целлюлозная сетка, называемая пленкой, плавает на границе раздела воздух-вода, окутывает и защищает растущие клетки, как биопленка.

Для большинства производителей на первом месте стоит не экологическая, а экономическая выгода от производства биоматериалов. BC обладает такой выгодой, так как выращивание происходит весьма быстро, дешево и устойчиво. Пленку BC можно вырастить за 7–14 дней с высокими выходами (> 10 г/л) из отходов (сок гнилых фруктов, глицерин, патока и т.д.). Кроме того, BC обладает улучшенными свойствами материала, такими как высокая прочность на разрыв, высокая водоудерживающая способность и высокая чистота.

ELM исследования бактериальной целлюлозы ранее были сосредоточены на генной инженерии Komagataeibacter и других организмов, таких как Saccharomyces cerevisiae, которые можно культивировать совместно с Komagataeibacter. Использование S. cerevisiae позволило производить пленки, способные воспринимать химические и световые раздражители и реагировать на них. Для облегчения генной инженерии Komagataeibacter был создан и охарактеризован модульный набор инструментов для клонирования генов Komagataeibacter (KTK от Komagataeibacter tool kit) с использованием Komagataeibacter rhaeticus. В этот набор инструментов синтетической биологии входит набор модульных частей ДНК, таких как конститутивные и индуцируемые промоторы, векторы и флуоресцентные маркеры. Все это послужило основой для создания модифицированного Komagataeibacter, который может производить альтернативные полимеры, такие как хитин и гиалуроновая кислота. Однако, как отмечают авторы исследования, несмотря на эти достижения, генную инженерию еще предстоит использовать для дальнейшего развития BC как устойчивого биоматериала в текстиле.

Биоматериалы в природе, такие как волосы и кожа, используют встроенные клетки для производства пигментов, которые окрашивают биоматериал in situ («на месте») экологически безопасным способом. Процесс, используемый при промышленной окраске тканевых материалов – крашение текстиля – требует химических реакций и наносит большой вред окружающей среде. Вдохновленные производством натуральных пигментов, авторы разработки решили создать самопигментирующийся BC материал с помощью генной инженерии K. rhaeticus.

Черный краситель — один из наиболее потребляемых красителей в мире, и его сложнее всего воссоздать с использованием экологически чистых подходов к окрашиванию. Ученые решили спроектировать биосинтез темного пигмента меланина (эумеланина) в K. rhaeticus. Эумеланин, вездесущий пигмент, встречающийся во всех биологических царствах, стабилен при высокой температуре и в течение длительного времени. Важно отметить, что эумеланин имеет низкую растворимость в воде, что способствует стойкости цвета. Кроме того, эумеланин обладает рядом других интересных свойств, таких как электропроводность, поглощение УФ-излучения и защита от ионизирующего излучения.

В рассматриваемом нами труде ученые демонстрируют, что производство пигментированной целлюлозы из K. rhaeticus может производиться в достаточно больших количествах. Кроме того, ученые описывают потенциал объединения биосинтеза меланина с другими инструментами синтетической биологии посредством оптогенетического формирования паттерна экспрессии генов в растущих BC пелликулах*.

Пелликула* — особый тип покровов у некоторых протист (группа, к которой относят все эукариотические организмы, не входящие в состав животных, грибов и растений). Представляет собой подстилающий плазмалемму слой плоских мембранных пузырьков ― альвеол.

Результаты исследования

Изображение №1

Рекомбинантное производство эумеланина было продемонстрировано в Escherichia coli и Vibrio natrigens. Для бактериального производства эумеланина требуется только один фермент (тирозиназа), который катализирует окисление L-тирозина до допахинона — стадию, лимитирующую скорость синтеза эумеланина. В оксигенированных и умеренных условиях допахинон спонтанно превращается в эумеланин в несколько этапов (1a). Прокариотическими тирозиназами, которые были протестированы в рекомбинантном контексте, являются MelA из Rhizobium etli и Tyr1 из Bacillus megaterium. В этом исследовании extyst решили сосредоточиться на Tyr1 из-за его меньшего размера и доказанного использования в немодельных организмах.

Используя KTK систему для модульного клонирования, ученые создали следующие два конститутивных экспрессирующих штамма Tyr1 K. rhaeticus: основанный на плазмиде K. rhaeticus ptyr1 и хромосомно интегрированный K. rhaeticus ctyr1 (1b). Оба штамма использовали идентичные части ДНК вокруг кодирующей последовательности tyr1. Промотором, использованным перед tyr1 для обеих конструкций, был синтетический конститутивный промотор pJ23104, который обладал самой высокой силой экспрессии из библиотеки промоторов, охарактеризованных у K. rhaeticus.

Синтез меланина с помощью Tyr1 чувствителен к pH и легко происходит только при значениях pH выше 7. Это противоречит росту K. rhaeticus, который, как уксуснокислые бактерии, подкисляет питательную среду во время роста за счет производства органических кислот, таких как глюконовая и уксусная кислоты. Было установлено, что пелликулы K. rhaeticus ptyr1, выращенные в среде HS-глюкозы с pH 5.7 и с необходимым субстратом и кофакторами для продукции эумеланина, не демонстрируют пигментации. Измерение подкисления питательной среды после образования пелликулы продемонстрировало, что pH культуры снизился до уровня ниже 4, даже когда исходный pH среды выше 7. Эти результаты показали, что необходимо отделить рост пелликул от производства эумеланина.

В связи с этим ученые решили использовать двухэтапный подход для получения меланина из K. rhaeticus. Первый этап включает выращивание K. rhaeticus, экспрессирующего Tyr1, в нормальных условиях роста, а второй этап включает удаление отработанной культуральной среды и замену ее буферным раствором с реагентами, необходимыми для синтеза меланина (1c). Для раствора, названного буфером для роста меланина, использовался PBS (pH 7.4), содержащий 0.5 г/л L-тирозина и 10 мкМ CuSO₄. Затем данный метод был протестирован на обоих штаммах, экспрессирующих Tyr1.

Чтобы количественно оценить выработку эумеланина, ученые проанализировали клетки K. rhaeticus, которые росли в условиях встряхивания, с добавлением в среду целлюлазы, которая предотвращает образование пелликул. Ученые измерили выработку эумеланина в буфере для роста меланина при OD₄₀₅ в течение 12 часов (1d). Оба штамма K. rhaeticus, экспрессирующие Tyr1, были способны продуцировать эумеланин. Скорость продукции меланина на исходную клетку была выше у интегрированного штамма тирозиназы K. rhaeticus ctyr1 (0.48 ± 0.03 OD₄₀₅/OD₆₀₀/ч) по сравнению с плазмидным K. rhaeticus ptyr1 (0.35 ± 0.02 OD₄₀₅/OD₆₀₀/ч; 1e).

Также было обнаружено, что щелочные буферы (> pH 8) приводят к более быстрому производству эумеланина, чем нейтральные. Однако скорость производства в щелочных буферах также быстро замедлялась, что приводило к общему снижению накопления меланина, чем при pH 8.

Затем ученые оценили, как изменились клетки K. rhaeticus после воздействия буфера для развития меланина. С помощью световой микроскопии было обнаружено, что клетки K. rhaeticus ptyr1 и ctyr1, подвергнутые воздействию буфера для развития, выглядели заметно темнее. Это позволяет предположить, что выработка эумеланина может происходить внутриклеточно (1f).


Изображение №2

Показав продукцию эумеланина клетками K. rhaeticus, экспрессирующими tyr1, ученые затем хотели продемонстрировать, что продукция эумеланина может эффективно пигментировать BC. Для этого они применили тот же двухэтапный процесс к статическим культурам K. rhaeticus ptyr1 и ctyr1, на которых выросли пеликулы (2a).

После 24 часов инкубации со встряхиванием при 30 °C в буфере пелликулы изменили внешний вид с бледно-желтого на коричневато-черный, демонстрируя пигментацию BC эумеланином (2b). После количественной оценки визуального потемнения K. rhaeticus ptyr1 и ctyr1 с течением времени в тестируемых условиях было установлено, что они достигали пика видимой темноты через 19 часов. Кроме того, уменьшив концентрацию L-тирозина в буфере, можно было замедлить скорость выработки меланина. Это позволяет варьировать степень пигментации пелликулы BC и, таким образом, генерировать материал в диапазоне коричневых оттенков.

Из-за высоких выходов материала, получаемого из простых статических культур роста, микробное производство BC легко масштабируется, что позволяет достичь количества BC, необходимого для создания реальных продуктов. Ученые хотели продемонстрировать, что есть возможность масштабировать рост Tyr1-экспрессирующего K. rhaeticus для производства функционально полезных количеств пигментированного BC. Для этого было рассмотрено два подхода к производству BC.

В первом подходе ученые стремились произвести стандартизированный лист меланированного BC, из которого можно было бы вырезать и собрать нетканый текстильный рисунок (то есть шаблон) (2c). Чтобы способствовать крупномасштабному росту BC, ученые перешли на питательную среду, содержащую кокосовую воду, 1% этанола и 1% уксусной кислоты. Выращивание проводилось в лотке 300 х 200 мм. После 10 дней производился сбор пелликулы, которая затем вырабатывала эумеланин, пока она не приобрела насыщенный черный цвет (2d). Затем меланированный лист BC стерилизовали в автоклаве, расплющивали и сушили. Лист BC сохранял свой цвет на протяжении всего процесса (видео №1).

Видео №1

Затем из двух меланированных листов вырезали выкройку. Затем части выкройки сшивались нитками для получения полноценного бумажника (2e).

Во втором подходе ученые воспользовались тем, что рост пелликулы следует за границей раздела воздух-вода и растет в той же форме, что и сосуд для культивирования (2f). Используя K. rhaeticus ptyr1, ученые вырастили пелликулу в специальном культуральном сосуде в форме выкройки верха обуви. Этот культуральный сосуд содержал устройство, похожее на ткацкий станок, содержащее сеть натянутых нитей лиоцелла (TENCEL), расположенных на границе раздела воздух-вода, что позволяло этим нитям включаться в растущую пелликулу K. rhaeticus ptyr1.

После 14 дней роста конечную пелликулу и аппарат удаляли из культуральной среды и помещали в буфер для проявки. Через 48 часов осторожного встряхивания при 30 °C пелликула приобрела темно-черный цвет (2g). Затем пелликулу стерилизовали в ванне с этанолом и замачивали в 5% растворе глицерина, а затем извлекали из аппарата, обертывали вокруг эпоксидной колодки обуви и давали высохнуть (2h).


Изображение №3

Образец меланированной целлюлазы, продуцируемой K. rhaeticus ptyr1, активно использовался в качестве демонстрационного образца в течение 42 месяцев и сохранял свою пигментацию на протяжении всего времени (3a). Помимо цвета, ученые хотели установить, как производство эумеланина могло повлиять на другие свойства материала BC. Чтобы выяснить это, ученые сначала проверили, изменил ли эумеланин поверхность BC, с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM от scanning electron microscopy). Было проведено сравнение верхней и нижней поверхностей, а также поперечных срезов меланированных и немеланированных пелликул K. rhaeticus ptyr1 (3b).

Снимки SEM показали минимальные структурные различия между меланированными и немеланированными пленками. Неровная морфология поверхности на снимках верхней поверхности объясняется остатками внедренных клеток, в отличие от более гладкой морфологии нижней поверхности. Кроме того, поперечные сечения меланированных и немеланированных пелликул ptyr1 показывают минимальные различия в пористости сети BC нанофибрилл.

Для дальнейшего изучения свойств поверхностного материала меланированной целлюлозы было проведено испытание на смачиваемость с использованием метода статической лежащей капли (3c). Используя пеликулы, выращенные из K. rhaeticus ptyr1, было установлено, что меланированная пелликула имела повышенную смачиваемость поверхности со средним углом смачивания 28° по сравнению с 47° для немеланированной пелликулы.

Одной из наиболее привлекательных особенностей BC для промышленности является его высокая прочность на разрыв. Поэтому было важно выяснить, меланизация снижает или усиливает прочность сети BC нанофибрилл. Ученые провели испытания на растяжение с использованием как меланированных, так и немеланированных пленок. Для обеспечения единообразия ученые подготовили парный набор образцов BC, разделив каждую выросшую пелликулу пополам и выделив эумеланин только в половине каждой пелликулы. Обе половины были подвергнуты тепловому прессованию для консолидации сети BC нанофибрилл в высушенные BC листы (3d).

Средние значения прочности на разрыв составили 91 МПа и 105 МПа для немеланированных и меланированных пленок соответственно (3e). Модуль Юнга составил 13.7 ГПа и 13.9 ГПа для немеланированных и меланированных пленок соответственно (3f). Для деформации при разрыве значения составили 1.02% и 0.98% для немеланированных и меланированных образцов соответственно (3g). Свойства материала всех испытанных образцов находились в ожидаемых диапазонах 70–300 МПа для прочности на растяжение и 5–17 ГПа для модуля Юнга. Сравнение образцов показало, что высушенный BC из меланированных и немеланированных пленок не обладал значительными статистическими различиями в свойствах материала при растяжении.


Изображение №4

Помимо окрашивания, обработка текстиля может также включать в себя создание рисунка на ткани. Чтобы продемонстрировать возможности генетически модифицированных самопигментированных нетканых BC материалов, ученые решили установить пространственный контроль экспрессии генов.

Было установлено, что наиболее гибким и точным способом формирования паттерна экспрессии генов будет использование инженерной оптогенетики. Потому создание рисунка выполнялось с помощью света (4a). Чтобы создать светочувствительный штамм K. rhaeticus, ученые решили внедрить светочувствительную к синему свету систему Т7-РНК-полимеразы (Opto-T7RNAP), первоначально разработанную для использования в E. coli (4b).

Для реализации системы Opto-T7RNAP у K. rhaeticus ученые протестировали два расположения необходимых участков ДНК. Были выбраны варианты с самым высоким кратным изменением между светлым и темным состояниями, где светочувствительные гены T7RNAP и светорегулируемый целевой ген были помещены в одну и ту же плазмиду. В качестве альтернативы светочувствительные вариантные гены T7RNAP были интегрированы в хромосому K. rhaeticus. Эти варианты штаммов T7RNAP K. rhaeticus затем были трансформированы отдельной плазмидой, кодирующей целевой ген (4c). В обеих схемах два светочувствительных гена Opto-T7RNAP регулировались промотором PBAD, который функционирует у K. rhaeticus при индуцировании арабинозой (C₅H₁₀O₅) в концентрации 2% (мас./об.). Ген-регулятор арабинозы (araC) был помещен ниже интегрированных двух светочувствительных генов Opto-T7RNAP как в хромосомном, так и в плазмидном расположении.

Затем была выполнена проверка, возможно ли моделировать экспрессию генов у K. rhaeticus, используя систему Opto-T7RNAP. Чтобы упростить этот процесс, ученые начали с того, что целевым геном был флуоресцентный репортерный ген, который продуцирует красный флуоресцентный белок (RFP от red fluorescent protein) mCherry. Ученые сконструировали проекционное устройство, которое могло проецировать изображение на поверхность культуральной жидкости по мере роста пелликулы. Затем ученые инокулировали K. rhaeticus pOpto-T7RNAP*(563-F2)-mCherry в сосуд для культивирования. Когда образовывалась тонкая пелликула, ее помещали под проецируемое изображение. Собранная пелликула продемонстрировала успешную картину экспрессии mCherry (4d). Пелликула показала изменение флуоресценции в 2.54 раза между наименее и наиболее экспонированной частью пелликулы (4e). Ученые также отмечают, что наименьшая область, которую они могли визуализировать, составляла 0.8 мм². Это позволяет оценить разрешение данного подхода (4f).

Перед тестированием ученые разработали динамическое изображение для проецирования и новую проекционную установку с использованием коммерческого доступного проектора. Данная установка позволяет изменять изображение во время экспозиции и, таким образом, измерять необходимое время экспозиции для генерации заметного ответа эумеланина. Используя K. rhaeticus Opto-T7RNAP(563-F1)-tyr1, ученые вырастили BC пелликулу в установке и после выращивания подвергли пелликулу воздействию 80-часовой проекции (4h).

Затем пелликулу помещали в буфер для проявки и инкубировали при 30 °C в течение 48 часов, после чего можно было наблюдать примерную картину накопления эумеланина (4i). К сожалению, хотя пелликула местами демонстрирует некоторые признаки формирования паттерна, высокая степень фонового накопления эумеланина также затрудняет расшифровку этой попытки формирования паттерна. Однако можно было определить по динамическому паттерну, что для наблюдения видимого накопления эумеланина требовалось не менее 40 часов, когда он продуцируется K. rhaeticus Opto-T7RNAP(563-F1)-tyr1.

В заключение ученые проверили, как себя будут вести другие варианты Opto-T7RNAP с tyr1 в качестве целевого гена. Ученые использовали аналогичный подход, что и ранее, но теперь измеряли накопление эумеланина на исходную клетку с течением времени при OD₄₀₅ (4j). Это показало, что для правильной работы K. rhaeticus pOpto-T7RNAP*(563-F2)-tyr1 требовалось 0.1% арабинозы, как это было, когда целью был mCherry (4g). Однако теперь в этом состоянии и во всех других испытанных условиях наблюдается высокая скорость продукции эумеланина даже в отсутствие световой индукции. Этот результат согласуется с высокой фоновой пигментацией, наблюдаемой в тестируемой пленке. Среди штаммов с хромосомно-интегрированной ДНК K. rhaeticus Opto-T7RNAP(563-F1)-tyr1 показал самую высокую скорость продукции эумеланина в ответ на синий свет, для настройки которого снова потребовалось 0.1% арабинозы. Изменение кратности между светлым и темным состояниями для этого штамма было ниже, чем для двух других протестированных вариантов, которые оба показали изменения кратности более чем в десять раз. Однако эти штаммы не идеальны для пигментации, поскольку у них гораздо более низкая скорость производства эумеланина.

Ученые отмечают, что контроль выработки эумеланина можно регулировать с помощью синего света и системы Opto-T7RNAP, но точное формирование паттерна накопления эумеланина в пелликуле еще предстоит оптимизировать.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые использовали генетически модифицированные бактерии, способные выращивать экологичный аналог кожи с функцией самопигментации.

Исследования, касающиеся экологии, нацелены не только на поиски альтернативных и зеленых типов энергии, но и на поиски альтернатив классическим материалам, которые используются повсеместно. Первым, что приходит в голову, является пластик, но не только он нуждается в замене. Синтетический текстиль также обладает негативным влиянием на окружающую среду, а потому должен быть заменен на нечто более экологичное, но и в то же время экономически выгодное и легкое в производстве.

Авторы исследования отмечают, что одно лишь окрашивание текстильных изделий наносит серьезный ущерб экологии, особенно пигменты темных цветов, используемые для окрашивания кожи. Альтернативой ученые называют свое творение — метод выращивания экологичного аналога кожи, основанный на бактериальной целлюлозе (BC от bacterial cellulose). Ученые отмечают, в отличие от альтернатив кожи на основе пластика, бактериальную целлюлозу можно производить без нефтехимических веществ, и она будет безопасно и нетоксично разлагаться в окружающей среде.

Основой нового материала стали генетически модифицированные бактерии, которые производят листы микробной целлюлозы — прочного, гибкого и податливого материала, который уже широко используется в продуктах питания, косметике и текстиле. Дополнительные генетические модификации заставляли бактерии производить темно-черный пигмент (эумеланин). Во время практических опытов ученые использовали форму в виде обуви (верхней части без подошвы), внутри которой происходило выращивание BC. После 14 дней роста, когда целлюлоза приняла правильную форму, обувь подвергли двум дням осторожного встряхивания при температуре 30°C, чтобы активировать выработку черного пигмента и окрасить материал. В другом опыте ученые вырастили выкройку, успешно использованную для изготовления кошелька.

Также было продемонстрировано, что бактерии можно сконструировать с использованием генов других микроорганизмов, чтобы они производили цвета в ответ на синий свет. Ученые проецировали желаемый рисунок на поверхность BC, в результате чего рисунок формируется изнутри материала.

В будущем ученые намерены провести ряд экспериментов для получения материалов разного цвета. Но уже сейчас они уверены в том, что их изобретение может изменить текстильную промышленность, тем самым снизив ее влияние на экологию.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?