Для нас, жителей суши, подводный мир кажется странным и от того очень любопытным: рыбы, которые заворачиваются в слизь на ночь, огромные млекопитающие, способные нырять на тысячи метров, головоногие, выстреливающие чернилами и многое другое. Все эти удивительные создания поражают воображение и порой шокируют своими удивительными способностями и внешним видом. У любителей дайвинга могут быть разные вкусовые предпочтения касательно мест для погружений, но никто не может отрицать красоту коралловых рифов. На первый взгляд кораллы кажутся неживыми, сделанными из камня структурами, или странными морскими растениями с твердыми стеблями и колючими листьями. Однако кораллы образуются из колоний полипов, имеющих известковый (или белковый) скелет. Несмотря на свой внешний вид, это вполне себе живые существа из класса беспозвоночных. И как любой организм, они обладают рядом специализированных клеток, выполняющих те или иные функции. Ученые из университета Майами (США) выявили в кораллах иммунные клетки, помогающие им бороться с инфекциями. Где эти клетки расположены, какие конкретно функции они выполняют, и какая польза от данного открытия? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых. Поехали.

Основа исследования

Иммунитет является неотъемлемой системой, обеспечивающей защиту организма от вредоносных бактерий и вирусов. Сам иммунитет можно разделить на две категории: приобретенный и врожденный. Приобретенные формируются в течение жизни организма, когда на него воздействуют те или иные антигены. Врожденный же можно охарактеризовать как превентивный, т.е. он обеспечивает защиту еще до попадания антигена в организм. Врожденный иммунитет позволяет распознавать чужеродные клетки и уничтожать их. Если эти функции не нарушены, то происходит активация сигнальных путей, приводящая к эффективному ответу на угрозу (фагоцитоз, коагуляция и антимикробная защита).

Фагоцитоз это процесс, когда специализированные клетки (фагоциты) находят, поглощают и переваривают твердые частицы. В некоторых случаях этот процесс связан с получением полезных веществ, но у многоклеточных он необходим для удаления отходов (поврежденных клеток) и патогенов.

Что касается изучения врожденного иммунитета, то хоть он и присутствует у всех видов животных и растений, больше всего мы знаем о таковом у позвоночных. Многие годы ученые пытаются понять, как этот тип иммунной защиты работает и у других организмов.


Черные кораллы являются одними из представителей класса Hexacorallia (шестилучевые кораллы).

Среди морских обитателей немалый прогресс был достигнут в изучение иммунитета стрекающих* (Cnidaria), в частности класса Hexacorallia (шестилучевые кораллы).

Стрекающие* — тип многоклеточных организмов, обитающих исключительно в водной среде. Обладают уникальными клетками — стрекательными, которые используют для охоты и защиты. Ярким примером стрекающих являются медузы.

В рамках изучения Hexacorallia понимание иммунной системы достигается посредством исследований гистологии, ферментативных реакций и геномного ответа на синтетические иммуностимуляторы, патогены, тепловой стресс и заживление ран.

Например, у каменных кораллов (Scleractinia) иммунитет, измеряемый реактивностью меланина, экспрессией флуоресцентного белка и активностью пропенолоксидазы, имеет обратную зависимость от смертности от обесцвечивания* и от восприимчивости к болезням. Это указывает на то, что иммунная система играет решающую роль в исходе этих реакций.


Обесцвеченные кораллы.

Обесцвечивание кораллов* — стресс, вызванный изменением среды обитания (температура, освещенность, соленость и т.д.), вытесняет симбиотические водоросли, живущие в тканях кораллов, что и приводит к обесцвечиванию.

Ученые отмечают, что многие иммунные гены (распознавание патогенов, протеолитический ответ, коагуляция, предшественники антимикробных пептидов и регуляция воспаления и апоптоза*) экспрессируются в ответ как на обесцвечивание кораллов, так и на воздействие болезней. Это подтверждает гипотезу о том, что врожденные иммунные реакции связаны со стрессовыми факторами в окружающей среде.

Апоптоз* — процесс запрограммированной гибели клетки, когда она распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Остатки клетки в последствии поглощаются макрофаги (т.е. фагоцитируются), что предотвращает воспаление.

Опыты также помогают лучше понять иммунную систему коралловых полипов. К примеру, в процессе заживления раны, обесцвечивания или болезни амебоциты* активно мигрируют к пораженному участку. Ученые предполагают, что амебоциты в случае с кораллами выполняют роль фагоцитов, т.е. поглощают поврежденные клетки и патогены.

Амебоциты* — группа клеток крови беспозвоночных животных.

Кроме того, было замечено, что в ответ на воздействие микропластика гастродермальные* клетки, которые демонстрируют поведение амебоцитов, поглощают его.

Фенотипически эти клетки демонстрируют признаки морфологии иммунных клеток: высокая внутриклеточная гранулярность в сочетании с амебоидной морфологией.

Гастродерма* — внутренний слой клеток, который служит выстилающей мембраной желудочно-сосудистой полости стрекающих.

Однако, пока многое указывает на фагоцитоз как на критически важную клеточную реакцию у Hexacorallia, многие из механизмов функциональных клеток фагоцитоза у Hexacorallia до сих пор мало изучены.

Возвращаясь к фагоцитам, стоит отметить, что у млекопитающих хорошо изучены пять специализированных типов профессиональных фагоцитов, которые отличаются от непрофессиональных тем, что на их поверхности есть молекулы (рецепторы), которые помогают идентифицировать чужеродные частицы. А вот у Hexacorallia профессиональные фагоциты описаны крайне плохо. Лишь недавно было установлено, что Nematostella vectensis есть клеточная структура, участвующая в фагоцитозе, а у Ctenophora есть фагоцитарные клетки.

После того, как клетки-мишени (патогены, отходы и т.д.) распознаются рецепторами иммунных клеток, они подвергаются эндоцитозу (захвату) в специализированные внутриклеточные везикулы (фагосомы), для деградации. Этот процесс требует быстрой перестройки актинового цитоскелета с образованием псевдоподиальных расширений, которые участвуют в поглощении частиц-мишеней.

Дополнительные лизосомные везикулы затем сливаются с фагосомой, что приводит к снижению pH и высвобождению пищеварительных ферментов. Конечные продукты деградации затем подвергаются экзоцитозу.

Такая везикулярная активность обычно сопровождается производством активных форм кислорода* (АФК), вызывая «респираторный взрыв» за счет активации комплекса НАДФН-оксидазы* внутри фагоцита, что дополнительно способствует разложению поглощенного материала.

Активные формы кислорода (АФК)* — ионы кислорода, свободные радикалы и перекиси неорганического и органического происхождения. В живой клетке АФК является продуктом нормального метаболизма кислорода.

НАДФH-оксидаза* — клеточный мембрано-связанный мультимолекулярный ферментный комплекс, локализующийся на плазматической мембране и в некоторых органеллах. Участвует в клеточной противомикробной защитной системе, а также в клеточной пролиферации, дифференцировке и регуляции экспрессии генов.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые предприняли попытки описать механизм фагоцитоза и его свойства у двух представителей Hexacorallia — Pocillopora damicornis и Nematostella vectensis.

Результаты исследования

Чтобы выявить фагоцитарные клетки P. damicornis и N. vectensis, было выполнено два фагоцитарных анализа посредством инкубации клеточной суспензии с карбоксилированными флуоресцентными микросферами или с неактивными частицами S. aureus. После выявления клеток, положительных по флуоресцентной метке, их сортировали и рассматривали с помощью флуоресцентной микроскопии (изображение №1).


Изображение №1

Диаметр клеток P. damicornis составлял примерно 10-20 мкм, а диаметр клеток N. vectensis — 10-15 мкм. У обоих видов отсортированные популяции клеток демонстрировали две различные морфологии, напоминающие фенотип гранулярного сфероида или амебоида. В редких случаях наблюдались филоподиальные* отростки (видео ниже).

Филоподии* — отростки, отходящие от мембраны клетки. Играют роль своеобразных сенсоров, собирающих химическую и физическую информацию об окружающем пространстве.

Дополнительный анализ трехмерных изображений и визуализация проточная цитометрия клеток N. vectensis с внедренными бактериями и гранулами показали, что частицы-мишени были действительно поглощены, а не находились вне поверхности клетки.

Ученые отмечают, что яркую зеленую флуоресценцию демонстрируют только поглощенные частицы S. aureus. Следовательно, поглощение бактерий сочетается со слиянием с лизолитическими везикулами, создавая среду с низким pH внутри фаголизосомы*, что необходимо для активации конъюгированного pHrodo флуорофора (1A, 1C и с увеличением на 1E).

Фаголизосома* — цитоплазматическая везикула, образованная слиянием фагосомы с лизосомой, которая поглощает твердые вещества, которые подошли к фагоцитозной клетке.

Везикула — внутриклеточные органеллы в виде полостей, окруженных мембраной, для хранения или транспорта веществ.

Чтобы увидеть, будут ли фагоцитирующие клетки P. damicornis и N. vectensis поглощать различные типы антигенов, ассоциированных с патогенами, было проведено несколько опытов с применением флуорофора pHrodo S. aureus (стафилококк золотистый), pHrodo E. coli (кишечная палочка) и pHrodo зимозана*.

Зимозан* / (C₆H₁₀O₅)_x — глюкан с повторяющимися звеньями глюкозы, соединенными β-1,3-гликозидными связями. Зимозан является лигандом, который часто можно обнаружить на поверхности грибов.

Все «испытуемые» были в той или иной степени поглощены рассматриваемыми клетками (2A).


Изображение №2

E. coli и зимозан были помечены pHrodo для подтверждения поглощения частиц и слияния с везикулами с низким pH, что и видно на 2B. Для подтверждения деградации фагоцитарной мишени использовался овальбумин* (2C-2E).

Овальбумин* — альбумин (простой белок) яичного белка.

В ходе исследования наблюдалось значительное поглощение и деградация яичного белка альбумина (2C), что было подтверждено с помощью конфокального 2D- и 3D-анализа (2D).

Более того, визуализирующий анализ проточной цитометрии показал, что деградация мишеней фагоцитоза происходит в компартментах фагоцитарных клеток, что свидетельствует о создании фаголизосом (2E).

Далее необходимо было выяснить, будут ли фагоцитарные клетки кораллов поглощать поврежденные клетки организма (а не внедренные извне). Для этого был использован тепловой стресс, вызывающий повреждение клеток коралла. В данном тесте использовалось две группы кораллов: тестовая (под стрессом) и контрольная (без стресса).


Изображение №3

В ходе наблюдений было замечено успешное поглощение фагоцитарными клетками поврежденных клеток (3A). Дальнейшая проверка этого наблюдения была проведена на N. vectensis с использованием анализа потока изображений (3B) и конфокального 2D и 3D анализа поверхности с поперечным сечением по оси Z. Результаты анализов также показали поглощение и полную интернализацию (обработка внутри фагоцитарной клетки) поврежденных клеток (3C и 3D).

Дабы лучше понять происходящее, необходимо было определить, является ли поглощение поврежденных клеток результатом активного фагоцитоза или пиноцитоза*. Для этого сравнивался процент клеток, поглощающих частицы, и клеток, которые поглощали флуоресцентно меченые молекулы сахара (декстран с молекулярной массой 500000) (4A-4F).

Пиноцитоз* — захват клеточной поверхностью жидкости с содержащимися в ней веществами / процесс поглощения и внутриклеточного разрушения макромолекул.

У P. damicornis процент всех живых клеток, которые фагоцитировали частицы-мишени или бактерии, составлял 12-14%. При этом 66% клеток пиноцитозировали декстран. А у N. vectensis 19-21% клеток фагоцитировали частицы-мишени или бактерии, а 82% пиноцитозировали декстран.


Изображение №4

У обоих видов процент клеток, поглощающих частицы-мишени, был разительно ниже процента клеток, поглощающих декстран. Для дополнительной проверки был проведен тест с частицами иного размера (диаметром 4 мкм), который показал снижение числа фагоцитов для обоих видов кораллов. А вот разные размеры декстрана (молекулярная масса 40000, 150000 и 2000000) показали незначительную разницу в пиноцитозе.

Более того, использование красных флуоресцентных микросфер в сочетании с декстраном не показало корреляции между декстраном и потреблением микросфер (4C).

Эти результаты подтверждают наличие специализированных клеток, ответственных за фагоцитоз.

Еще один метод подтвердить наличие фагоцитарных клеток, это ингибировать актиновые филаменты (F-актин), влияющий на фагоцитоз, но не на пиноцитоз. В результате у P. damicornis уровни общего количества клеток с поглощенными частицами и бактериями значительно снизились при воздействии латрункулина А, в то время как процент клеток, поглощающих декстран, не изменился (4G-4L).

Эти результаты предполагают, что фагоцитарная активность у исследуемых видов требует перестроек цитоскелета, основанных на актине, чтобы производить псевдоподиальные* расширения, связанные с поглощением крупных частиц в отличие от пиноцитоза, когда поглощаются малые молекулы.

Псевдоподия* — цитоплазматические выросты у одноклеточных организмов и некоторых видов клеток многоклеточных, используемый для передвижения и улавливания крупных частиц.

Изображение №5

Далее была выполнена оценка наличия внутри клеток маркеров, аналогичных маркерам фагоцитов млекопитающих, таким как лизосомы с низким pH и АФК. Для этого использовали маркеры присутствия лизосомных везикул (LysoTracker) и АФК (CellROX), после чего клетки отсортировали на основании высокого и низкого числа этих маркеров. При этом скорость поглощения микросфер напрямую ассоциируется с маркерами лизосомных везикул и АФК.

У N. vectensis клетки с высоким уровнем сигнала лизосом и АФК показали значительно более высокие скорости поглощения частиц, чем клетки со слабым сигналом (5A). Аналогичные результаты были получены с популяциями клеток P. damicornis (5B). В совокупности эти результаты предполагают, что сортировка клеток, основанная как на высоком сигнале лизосомных везикул и АФК может значительно увеличить популяции фагоцитарных клеток.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых.

Эпилог

В данном труде ученые доказали наличие у кораллов Hexacorallia специализированных клеток, способных избирательно поглощать бактериальные и грибковые антигены, частицы и поврежденные клетки, т.е. участвующих в фагоцитозе. Обнаруженные клетки также демонстрируют классические признаки опосредованной лизосомами деградации, о чем свидетельствует снижение везикулярного pH при поглощении бактерий в сочетании с высокой продукцией АФК и присутствием гидролиза, управляемого протеазой.

Данное открытие особенно важно для самих кораллов. За последние десятилетия площадь коралловых рифов значительно сократилась, что имеет колоссальное влияние на жизнь всей подводной экосистемы. Понимая, как именно кораллы борются с патогенными частицами, ученые смогут разработать более эффективные методики поддержания и восстановления коралловых рифов.


Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличных всем выходных, ребята! :)

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?