Автор сообщества Фанерозой, биотехнолог, Людмила Хигерович.

Продолжаем знакомить вас с тонкостями работы биотехнологов. Готовы поспорить, что каждый из чтецов этого текста слышал о генно-модифицированных организмах, сокращенно ГМО. Кто-то их боится, кто-то считает их спасением от глобальных проблем человечества, кому-то абсолютно все равно.

Однако мы готовы поспорить, что большая часть читателей даже не представляет, как на практике создают этих самых ГМО или, как их правильнее называть в среде ученых, трансгенных организмов и генетических химер.

Справка

Химера или химерный организм — организм, несущий в себе генетический материал, принадлежащий двум и более видам живых существ. Химерой может быть как многоклеточный организм, так и одноклеточный. Кроме того, различают химер по тому, насколько и в каком качестве присутствует чужеродный геном: заимствована ли часть генов, встроены ли они в хромосому реципиента, или же оба генома сохранены полностью, но располагаются в разных клетках. Впрочем, это тема для отдельного поста.

Итак, чтобы создать генетически модифицированный организм, надо изменить его геном. В научной среде изменение генома называется трансформацией.

Трансформация генов – это изменение генетического состава клеток путем привнесения извне чужеродного генетического материала, перенос чужеродных (природных или искусственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений, животных и микроорганизмов, и получение таким образом трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками.

Секундное отступление. Трансформация — не изобретение человека. Бактерии умели передавать друг другу ДНК, захватывать чужую и встраивать ее в свой геном еще задолго даже до появления вирусов. Более того, эти свойства не утрачены даже у более развитых организмов. И, что еще более интересно, природная трансформация, также известная как горизонтальный перенос генов, играет огромную роль в эволюционных механизмах. Но это весьма обширная тема.

Стоит отметить, что трансформация имеет свои особенности для растений и животных. Растительные клетки из-за плотной клеточной стенки поверх мембраны неспособны самостоятельно поглощать фрагменты чужеродной ДНК и воспроизводить их, тогда как клетки животных могут различными способами поглощать фрагменты ДНК, встраивая их в свой геном, или поддерживать их воспроизведение в цитоплазме.

Исходя из этого учеными было разработано два основных метода генетической трансформации растений и еще пять – для животных. Разумеется, на самом деле их гораздо больше, однако по большей части это модификации основных семи. Рассмотрим вкратце каждый из них.

Векторный

По сути является лабораторной адаптацией механизма, называемого трансдукцией — обмен генами у бактерий и некоторых простейших. Пожалуй, он так же заслуживает отдельной статьи, но постараемся кратко.

Вектор — трансформирующий фактор, основой которого является самостоятельный фрагмент ДНК, несущий все необходимое для синтеза РНК и белка. Обычно на основе ДНК или РНК вируса, плазмиды или космиды (свободные генетические элементы бактерий и простейших).

В промышленной и сельскохозяйственной биотехнологии обычно создают векторы с помощью Ti-плазмид бактерий, так как они небольшие по объему, и относительно устойчивые.
Как их создают? Из плазмид выделяют участки Т-ДНК (транспортной), ответственные за встраивание в молекулу ДНК клетки-мишени и создают векторные ДНК (векторы), способные переносить и встраивать нужные последовательности, включая части, кодирующие нужный признак и вещество, а также маркеры (репортерные гены — они нужны для проверки — встроился ли вектор в ДНК реципиента).



Модифицированные агробактерии (или освобожденные плазмиды) помещают в одну среду с растительными клетками-реципиентами, откуда с помощью антибиотиков удаляют нетрансформированные клетки.

К векторной трансформации также относят перенос ДНК с помощью ретровирусов. Векторный перенос можно осуществить только при отсутствии клеточной стенки (т.е. необходимо привести клетку-донор в состояние протопласта).

Трансформированные клетки помещают в питательную среду для культивации (образование каллуса), впоследствии регенерируя из них целое растение.

• Плюсы: адресность (можно сделать так, чтобы вектор встраивался только в определенные участки), возможность проконтролировать встраивание вектора и его сохранность в следующих поколениях клеток.
• Минусы: большая подготовительная работа по синтезу и созданию вектора и его размножению, опасность случайных встраиваний.

Биобаллистический (Генный пистолет)

Биобаллистический или метод «генного пистолета» – применяют в основном в отношении однодольных растений, нечувствительных к агробактериям.

Пожалуй, это самый фантастический способ трансформации. И самый страшный для людей, которые всерьез боятся стать жертвами генной модификации. Ведь его принцип действия полностью соответствует его названию. Да, именно так — это пистолет, стреляющий… генами.


В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток-мишеней. Как вариант этого метода встречается магнетофекция – перенос с помощью намагниченных металлических частиц.

• Плюсы: мобильность (можно таскать с собой в поле) и массовость (обработка большого количества клеток разом или целого растения).
• Минусы: внесенная ДНК практически ничем не защищена и может быстро потерять активность, нельзя проконтролировать встраивание.

Векторный и биобаллистический методы универсальны и для растений, и для бактерий, и для животных. Теперь же переходим к методам, характерным для трансформации животных клеток. В принципе, их так же можно применить на растительных клетках, однако придется лишить их клеточной стенки, и знатно повозиться с подготовкой клетки.

Метод микроинъекций

Это самый простой способ внести ДНК в клетку. Вы часто видели его в научно-фантастических фильмах на тему утечки какого-нибудь патогена из секретной лаборатории.

Суть ее заключается во введении целевых генов непосредственно в ядро животной клетки при помощи микрокапиллярной пипетки. Под микроскопом в ядро клетки вводится 1 × 10^(−10)—1 × 10^(−12) л раствора трансформирующей ДНК (несколько тысяч копий генов).

• Плюс: главный плюс этого метода в том, что введенный ген сохраняется внутри клетки, а клеточные структуры почти не повреждаются.
  
• Минус: при делении клетки только одна из дочерних клеток наследует дополнительную ДНК

Электропорация

Впервые была разработана в лаборатории Е. Неймана в 1982 т. для введения чужеродных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки.

В многочисленных опытах было показано, что обработка клеток животных электрическими импульсами с напряженностью поля 5-10 кВ/см в течение 5-10 мкс приводит к поглощению клетками молекул ДНК, находящихся в среде.

• Плюсы: простота использования (кладем клетки в ванну с электролитом, капаем ДНКу, врубаем ток, профит!).
• Минусы: плохая контролируемость встраивания, повреждения ДНК и клеточных мембран.

Липофекция

С чем-то подобным сталкиваются блюстители красоты, пользующиеся лосьонами с мицеллами и принимающие жирорастворимые витамины.

Липосомы (мицеллы, везикулы) — “пузырьки” из одного или двух слоев липидов, по свойствам схожих с естественной клеточной мембраной. В основном различают так: липосомы — двухслойные, содержат комплекс гликолипидов, мицеллы — однослойные, преимущественно липидные. Но это не точно:)

Липосомный (везикулярный) метод – пиноцитозное (захват раствора) поглощение метафазных хромосом, заключённых в синтетическую фосфолипидную оболочку (линохромосом или липоплекса). Изолированные метафазные хромосомы способны проникать в чужеродную клетку и функционировать в ней в течение некоторого времени.



Большая часть поглощенных хромосом деградирует, распадаясь на отдельные фрагменты, осуществляющие перенос содержащихся в них генов. Фрагменты могут существовать в свободном состоянии. Гены трансгенома функционируют наряду с другими своими хромосомными генами клетки. Такие популяции клеток называют нестабильными.

При постоянном действии генов трансгенома появляются стабильные популяции клеток (клоны) – когда сохранившийся фрагмент интегрируется с хромосомой клетки реципиента. Интеграция происходит не путем рекомбинаций через двойной кроссинговер, а через транслоцирование фрагментов на негомологичные участки генома реципиента.

Соматическая гибридизация

Слияние соматических клеток с объединением их геномов — образование гибридома. Производится электрическим, химическим и механическим путем. Частный случай гибридизации – использование микрокеток, иногда объединяют с липофекцией.



Введение с помощью микроклеток – клетки доноров обрабатываются таким образом, что часть хромосом или отдельные хромосомы оказываются заключенными в часть цитоплазмы. Слияние микроклетки донора с полноценной клеткой реципиента ведет к тому, что реципиент получает группу или отдельные хромосомы донора.

Это один из самых трудоемких методов создания трансформированных клеток. Однако он полностью оправдывает себя — так, например, производят антитела для лечения редких заболеваний, иммуноглобулины и создают из клеток больных раком пациентов индивидуальные лекарства.

Химическая преципитация

Метод несколько схож с генным пистолетом с той лишь разницей, что частицы ДНК не выстреливаются, а доставляются на соли.

Например, преципитация фосфатом кальция выглядит следующим образом. ДНК добавляют к смеси раствора СаСl2 и фосфатного буфера, ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция (Грэхем Ван дер Эб, 1973). Образуются частицы кальциевого преципитата. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза.

Основные методы трансформации закончились. Познакомимся с редкими, но все же встречающимися — некоторые из них весьма любопытны.

Органическая преципитация. Катионные полимеры

По сути, гибрид химической преципитации и фагоцитоза. В основном используют ДЕАЕ-декстран. Преципитация диэтиламиноэтил-декстраном (ДЕАЕ-декстраном) – использование положительно заряженных (катионных) водорастворимых полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран, полиэтиленимин, поли-L-лизин или хитозан. Отрицательно заряженная ДНК связывает поликатионы, и образовавшийся положительно заряженный комплекс (полиплекс) взаимодействует с отрицательно заряженной мембраной клетки, что приводит к проникновению ДНК в клетку-мишень путем эндоцитоза. Метод считается малоэффективным из-за сложности с синтезом комплекса и слабом контроле доставки ДНК в ядро.

Фототрансфекция

Перенос фрагментов ДНК через поры, образованные в результате сверхкороткого облучения лазером. По сути, та же электропорация, только вместо тока — свет определенной длины волны.

Трансдукция

Вариация векторного метода для животных клеток. Имеет ряд отличий, например, в качестве вектора применяется фрагмент вирусной ДНК (ретровирусы, ДНК-вирусы, ВИЧ), чаще всего заключенный в реконструированную вирусную оболочку для облегчения проникновения в клетку и обеспечения тканеспецифичности.

Есть и еще менее популярные методы, как, например, трансформация тепловым шоком. Однако она сама по себе не привносит ДНК извне, лишь изменяя структуру существующей ДНК за счет температурных повреждений. Либо тепловой шок может служить тем же фактором повреждения мембраны, что и электрошок, открывая путь для проникновения ДНК. Но в таком случае, по сути он ничем не отличается от вышеназванных.

Итак, мы рассмотрели основные методы создания химерной (трансформированной) клетки или популяции клеток. Несмотря на то, что их характеристика по большей части уместилась в паре строк, каждый из них сопряжен с колоссальными усилиями как при подготовке, так и при исполнении, и тем более при контроле результата. Последнее особенно важно, так как любая клетка имеет свои механизмы защиты.

Мало трансформировать геном, надо еще обеспечить его сохранность и устойчивость — в противном случае, клетка быстро избавится от чужеродного фрагмента, вырезав его или растворив в лизосоме.

Для чего это делают?

На самом деле, трансформированные организмы давно уже нас окружают и служат нам. Стоит только подумать над тем, что первые научные работы на эту тему (на тему трансформации у бактерий) датированы до 1962 года, т.е. до подтверждения структуры ДНК! А сами бактериальные химеры стали применять аж в 1980-х.

Выше мы уже упоминали, что с помощью гибридов изготовляют лекарства от рака и редких заболеваний. Также с помощью трансформированных клеток производят гормоны (человеческий инсулин, ген которого перенесли в кишечную палочку), иммуноглобулины, белки, витамины (витамин С с помощью той же кишечной палочки, фитогормоны для растений с помощью сенной палочки), ферменты для пищевой, текстильной, химической промышленности, биоудобрения и биопрепараты для борьбы с паразитами и вредителями, антибиотики и даже очищают сахар (хотя это совсем уж редкий случай).

Вот вы узнали еще немного о биотехнологии.
Всего хорошего и не болейте!