![](https://habrastorage.org/webt/qt/de/yu/qtdeyufpaiguznan2c4h3oxenvk.png)
Ни для кого не секрет, что существуют вещи и организмы настолько маленькие, что увидеть их невооруженным глазом просто невозможно. Однако за последние сто лет наука шагнула далеко вперед. И теперь мы можем не только посмотреть на инфузорию, но и увидеть собственными глазами атомы, и даже, буквально, пощупать рельеф микроструктуры кристаллов. А все благодаря электронной микроскопии… Давайте разберемся, как такое возможно.
Перед вами небольшой обзор на электронные микроскопы и их возможности.
![](https://habrastorage.org/webt/nb/ak/nz/nbaknzzaeb4y0upnxqvap7q8ap8.png)
Изображение вируса Эбола, полученное при помощи просвечивающей электронной микроскопии
Несмотря на то, что «электронная микроскопия» звучит очень современно, запатентована она была еще в 1931 году германо-американским инженером и изобретателем Райнхольдом Руденбергом. Это был настоящий переворот в области изучения микроструктур.
В световом микроскопе, которым на тот момент пользовались исследователи, изображение давали световой луч и незамысловатая конструкция из оптических линз. В электронном микроскопе (ЭМ) роль луча выполнял поток электронов в вакууме, фокусируемый, словно линзами, электромагнитными катушками. Изображение передавалось на флюоресцирующий экран, где его можно было детально рассмотреть. Данная технология позволила исследовать микроструктуры твердых тел, их локальный состав, а также электромагнитные поля. |
▎В чем суть электронной микроскопии?
Как уже было сказано, на исследуемый объект подается пучок электронов, который фокусируется на образце при помощи электромагнитного поля. «Точка» фокусировки электронов имеет не более 5 нм в диаметре. Для сравнения, толщина волоса — 80 000 нм. При соприкосновении с объектом электроны частично проникают внутрь, вытесняя родные электроны и фотоны образца, которые, в свою очередь, попадают на лучевую трубку, где и формируется изображение.
▎Каковы преимущества электронной микроскопии?
- Первое и основное отличие от светового микроскопа — увеличение. Профессиональный современный световой микроскоп может увеличить изображение в 2 тысячи раз. Электронный микроскоп дает увеличение до 300 тысяч при разрешающей способности 0,5 нм. На таком увеличении уже можно рассмотреть атомы.
- Второе существенное преимущество — при помощи спектрального анализа рентгеновского излучения, возбуждаемого электромагнитным полем, можно изучить химический состав образца в конкретных точках.
- В процессе можно воздействовать на исследуемый объект: облучать, нагревать, намагничивать или деформировать. И полученная картинка будет динамически изменяться.
- Имеется возможность зафиксировать процессы на фото- или видеосъемку в высоком разрешении.
- Исследователь получает электронно-оптическую информацию, которую можно дополнить данными, основанными на дифракции электронов с материалом исследуемого объекта. К примеру, определение показателей кристаллографии при использовании дифракционного контраста.
- В растровой разновидности электронной микроскопии можно рассматривать рельеф поверхности объекта при помощи анализа катодолюминесценции.
▎А каковы недостатки?
А вот недостатков много:
- Во-первых, в отличие от светового микроскопа, в котором образец можно просто поместить под окуляр, в ЭМ для работы необходим вакуум. Поэтому исследуемые образцы должны быть хорошо обработаны и зафиксированы. А потому невозможно исследовать живые объекты.
- Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.
- В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.
- Из-за повышенной чувствительности и хрупкости ЭМ нужно размещать абсолютно неподвижно, на виброустойчивой колонне, в здании без внешних магнитных полей.
- ЭМ создает исключительно черно-белые изображения.
- И, конечно, стоимость. Далеко не каждый исследовательский центр может позволить себе ЭМ. Он дорог и при покупке, и в обслуживании.
Теперь давайте рассмотрим основные виды электронной микроскопии.
А основных видов два:
- Трансмиссионная или просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
- Растровая или сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/a49/983/9ca/a499839ca58814631726e6cd2254232d.png)
Нитчатая водоросоль в световом микроскопе (а), СЭМ (б) и ПЭМ (в)
▎Просвечивающий электронный микроскоп
ПЭМ похож на обычный световой микроскоп, но вместо луча света используется поток электронов, а длина волны намного меньше, чем фотонная. Поэтому изображения получаются в более высоком разрешении.
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/402/d2d/1d7/402d2d1d7e6a051880b5f38e90f6b97a.png)
Вирус свиного гриппа в просвечивающим электронном микроскопе
Фокусировка электронного потока осуществляется при помощи электромагнитных и электростатических линз. Возникают даже присущие фотонным микроскопам хроматические аберрации. Только природа такого искажения абсолютно иная. Кроме того, за счет закручивания электронов вдоль оси пучка в линзе, возникают дополнительные искажения.
У ПЭМ очень высокое разрешение, что позволяет разглядеть атомы вещества и детально рассмотреть, к примеру, возбудителя вирусного заболевания. Собственно, с появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА), электронным микроскопом перестали активно пользоваться для определения вирусов. И дело опять в стоимости и трудоемкости.. |
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/04f/991/703/04f99170302c3464d1aa6e1adfa1cf72.png)
ㅤㅤㅤПросвечивающий электронный микроскоп
▎Сканирующий электронный микроскоп
СЭМ позволяет получать изображение очень высокого разрешения. Узко сфокусированный луч электронов микрон за микроном сканирует поверхность изучаемого образца. СЭМ дает возможность, в том числе, получить трехмерное изображение. У данного типа микроскопов имеется большое количество датчиков, способных улавливать все вытесняемые электронами частицы: электроны, видимый инфракрасный и ультрафиолетовый спектры света, рентгеновское излучение.
В отличие от ПЭМ, работа которого похожа на работу оптического микроскопа, работа СЭМ напоминает устройство старого телевизора. В таких телевизорах есть электронно-лучевая трубка. По ней в вакууме проходят электроны, испускаемые электронной пушкой, и есть система корректирующих движение линз, которые могут фокусировать или отклонять электроны. В СЭМ все то же самое, только электронами обстреливают исследуемый объект, а не люминофоры экрана, а вся поступающая информация фиксируется различными детекторами.. |
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/fdf/5b2/25d/fdf5b225d0f19d57d6ec1c9dccd93dff.png)
ㅤㅤСканирующий электронный микроскоп
У СЭМ есть несколько принципиально разных режимов работы, которые зависят от детекторов.
Рассмотрим основные виды:
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/8d0/8c2/053/8d08c2053c6874f21d26a8819b50556d.png)
Изображение пыльцы, полученное путем детектирования вторичных электронов
![](https://habrastorage.org/webt/dv/mp/py/dvmppy0xq9q-ci729tb6dztwznc.png)
Морфология интерфейса между оксидной и металлической составляющими, сделанная в режиме детектирования отраженных электронов
![](https://habrastorage.org/webt/rg/vn/uq/rgvnuqb4t7xod8_xq5dvkqiasmc.png)
Анализ элементного состава микрокомпонентов полированного образца анодного шлака с помощью энергодиспрсионного спектрометра
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/136/a54/505/136a545051e5f4600e5e4afa48feb95b.png)
Коррозия, распространяющаяся сквозь хромовое покрытие на стали. Изображение получено при помощи детектирования прошедших электронов.
Катодолюминесценция — это, по сути, способность вещества замещать оставленные после облучения электронами дырки, захватывая свободные электроны и выделяя световую энергию. Это свойственно для металлов: чистых и с примесями. Свет, производимый металлом с примесью, будет другого оттенка, что и будет фиксироваться детектором.. |
![](https://habrastorage.org/webt/2o/7n/7j/2o7n7jf0ghm1qvf6ebwxc4kw9-w.png)
Изображение циркона, полученное
при детектировании катодолюминесцентного излучения
СЭМ может работать исключительно с твердыми образцами в вакууме. Поэтому для работы с жидкостями, их необходимо подвергнуть глубокой заморозке. Зато форма и размер образца могут быть любыми в пределах объема рабочей камеры. Продуктивность работы повышается при нанесении на исследуемый образец тонкого слоя токопроводящего материала.
Электронная микроскопия применяется во многих сферах науки и промышленности:
В некоторых сферах электронная микроскопия незаменима. Поэтому исследователи постоянно работают над усовершенствованием методов и возможностей в данной области. Рассмотрим некоторые из них. |
▎3D моделирование
В некоторых случаях, к примеру, в биологии и медицине, могут потребоваться не просто фотографии ультратонких срезов, а трехмерные изображения какой-либо ткани или организма.
Это возможно осуществить несколькими способами:
![](https://habrastorage.org/webt/ai/lv/m4/ailvm48m8moj1zywmakwsv2sudc.png)
Принцип метода криоэлектронной томографии
В процессе КЭТ объект исследования постепенно поворачивается и изображения получаются под разным углом наклона. После этого все фотографии сводятся в одно 3D изображение. Минус метода в том, что образец получает высокую дозу излучения, за счет чего часть мелких деталей теряется в процессе исследования.
![](https://habrastorage.org/webt/uw/dc/xm/uwdcxms6qamkyuyfu8y-bedq7-e.png)
Раскрашенное изображение бактериофагов
(зеленые), поразивших кишечную палочку (голубые), сделанное в ФИЛ-СЭМ
Сложность метода в подготовке. Перед проведением операции необходимо защитить образец от части заряда. Для этого на сам объект, к примеру, кусок органа, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта — 100*100 мкм. Кроме того, метод очень долгий, а с увеличением глубины резки снижается качество.
![](https://habrastorage.org/webt/a8/ry/va/a8ryvahlduarubdypxl6rzyefkm.png)
Принцип метода ФИЛ-СЭМ
![](https://habrastorage.org/webt/dw/pt/zy/dwptzyhypvrmo4atntyyawmygge.png)
Ультрамикротом со специальной насадкой и вставленной лентой для срезов
▎Цветное изображение
Большим минусом ЭМ является черно-белое изображение. Однако и с этим ученые смогли справиться.
Самый простой метод — коррелятивная свето-электронная микроскопия (КСЭМ). Для окрашивания изображения один и тот же объект фотографируется в световом и в электронном микроскопе, а затем программа соединяет два изображения. Однако из-за разницы в разрешении изображение лишь радужно подкрашивается согласно распределению флуоресцентного красителя. Выделить микроструктуры таким образом не удастся. |
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/454/abe/2a7/454abe2a7cc19487c07164b71514847a.png)
Коррелятивная свето-электронная микроскопия элементов цитоскелета
Ученые объединили КСЭМ с трехмерной световой микроскопией, уже известной нам ФИЛ-СЭМ и с микроскопией сверхвысокого разрешения (СР-микроскопия), которая позволяет получить большее разрешение за счет объединения на экране множества снимков.
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/c46/987/672/c4698767251f20945d47345f0761cddb.png)
Срез ядер нейронов при микроскопии сверхвысокого разрешения
Составив изначально изображение высокого разрешения, ученые резали образец лучами ионов. Изображение получало цвет за счет световой микроскопии структурированного освещения, позволяющего увеличить разрешение снимка в два раза за счет поочередной подсветки отдельных точек при фоновом свечении остального образца, и одномолекулярной световой микроскопии, при которой флуоресценция красителя активируется слабым лазером. Одномолекулярная микроскопия позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения свели вместе и получили полноценные цветные снимки. С помощью данной методики удалось разглядеть, к примеру, ультраструктуру нейронов.
![](https://habrastorage.org/getpro/habr/post_images/823/8c0/365/8238c03656f4bc929aeb8637f75d417d.png)
Трехмерные модели ядер нейронов, полученные при коррелятивной микроскопии
Итак, электронный микроскоп — вещь, во многих сферах незаменимая. Ученые потихоньку нивелируют его минусы и решают проблемы, связанные с его использованием. Возможно, в скором времени, из минусов останутся только размер и стоимость. Хотя… Может, и это исправимо?
Автор: Соловьёва Софья, микробиолог. |
- Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Ф. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в двух книгах. Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. 303 с.
- Уманский Я. С., Скаков Ю. А., Иванов А. Н., Расторгуев Л. Н… Кристаллография, рентгенография и электронная микроскопия. — М.: Металлургия, 1982, 632 с.
- СиндоД. Оикава. Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. — М.: Техносфера, 2006, 256 с. ISBN 5-94836-064-4.
- Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology, 2(11).
- Efimov, A. E., Tonevitsky, A. G., Dittrich, M., & Matsko, N. B. (2007). Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: A novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy, 226(3), 207–217. doi.org/10.1111/j.1365-2818.2007.01773.x
- Peddie, C. J., & Collinson, L. M. (2014). Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. Elsevier Ltd. doi.org/10.1016/j.micron.2014.01.009
- Schalek, R., Kasthuri, N., Hayworth, K., Berger, D., Tapia, J., Morgan, J., … Lichtman, J. (2011). Development of High-Throughput, High-Resolution 3D Reconstruction of Large-Volume Biological Tissue Using Automated Tape Collection Ultramicrotomy and Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 17(S2), 966–967. doi.org/10.1017/S1431927611005708
- Wagner, J., Schaffer, M., & Fernández-Busnadiego, R. (2017, September 1). Cryo-electron tomography—the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. Wiley Blackwell. doi.org/10.1002/1873-3468.12757
-
https://biomolecula.ru/articles/tsvet-3d-i-sverkhvysokoe-razreshenie-novaia-razrabotka-v-mikroskopii
Комментарии (24)
SciTeam
09.11.2022 11:40+9Одно из самых интересных изображений, полученных с помощью электронного микроскопа, показывает, что трансляция белка осуществляется несколькими рибосомами одновременно.
ssj100
09.11.2022 11:52+2то есть эти 2 тонкие нити это РНК или ДНК ?
SciTeam
09.11.2022 12:27+5Здесь ДНК нижняя тонкая нить, а РНК верхняя, на которой рибосомы синтезируют белок (более толстые структуры). Тут заодно показано, что транскрипция и трансляция у прокариот (организмов без ядра) происходят примерно одновременно.
bbs12
09.11.2022 21:06+1трансляция белка осуществляется несколькими рибосомами одновременно
Интересно, это один и тот же белок создаётся разными рибосомами? Или одновременно разные белки? По идее на одной нитке рнк могут сидеть тысячи рибосом и вот так штамповать белки? Какой механизм отвечает за расстояние между соседними рибосомами, а то на фото они как-то не равномерно расположены. Возможно всё-таки разные белки производят.
VoronaDragon
10.11.2022 15:01+1Насколько я знаю, у бактерий может идти трансляция одного белка несколькими рибосомами, у более высокоорганизованных точно не знаю. Разных белков точно могут, если активатор подошли одновременно.
Расстояние между рибосомами (по крайней мере, у тех, с которыми я работала) случайное, но не меньше диаметра одной рибосомы.
vilgeforce
09.11.2022 12:25+4Какой электронный микроскоп использовался для получения заглавной фотографии?
QDeathNick
09.11.2022 19:25И не очень понятно что на фотографии. Кто знает?
bbs12
09.11.2022 21:08+2"Две клетки мыши, находящиеся в стадии профазы. Микрофотография получена с помощью флуоресцентного микроскопа (масштабная линейка соответствует 5 мкм) ."
https://ru.wikipedia.org/wiki/Профаза#/media/Файл:3D-SIM-3_Prophase_3_color.jpg
InBioReactor Автор
09.11.2022 23:13Это микроскопия структурированного освещения. Микроскоп конкретно для этого фото использовался световой.
Ученые использовали данную методику в процессе разработки методов "окрашивания" изображений электронного микроскопа.
Об этом методе есть немного в конце статьи.
На изображении профаза митоза, визуализированная методом SIM
vilgeforce
10.11.2022 12:09+1Ну что ж вы так... Статья про электронную микроскопию, а заглавное фото - световое :-D
Dmytro_Kikot
09.11.2022 15:20+1Спасибо большое за увлекательный материал.
Мне это напомнило историю об Игнаце Земмельвейсе, который, будучи акушером, предложил коллегам мыть руки и инструменты (микробной теории тогда еще не было). Смертность снизилась в разы. Однако многие коллеги смеялись над ним, считая его теории глупостью. Затем его уволили и смертность вновь пошла вверх. Из-за этого у него произошел срыв, его насильно помести в лечебницу, где он и скончался (от избиений со стороны медработников). Зато спустя много лет предложенные им методики стали нормой.
koreec
09.11.2022 16:23+3Вот это просвечивающий электронный микроскоп:
А у вас на картинке дрова какие-то.
phenik
09.11.2022 17:31Поглощение электронного потока в образце, один из недостатков эл. микроскопов, снижающих их эффективность, возможно будет преодолен с помощью кв. запутанности, как это смогли сделали для оптических микроскопов (статья).
krylov_sn
09.11.2022 17:54+2Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.
Неправда.
Если речь идет про TEM (трансмиссионный электронный микроскоп), то - да. Там и длительная подготовка образца нужна, и тонкий срез.
А вот в случае SEM (сканирующий электронный микроскоп), делать срез вовсе необязательно. Микроскоп может работать и на отраженных электронах. Подложка (например из кремния) обычно имеет толщину 1-2 мм, с маленькими структурами на ней микронного или нанометрового размера, толщиной в несколько нанометров. И замечательно все видно. Никто не срезает подложку. Как раз-таки SEM используется очень широко из-за относительной простоты подготовки образца и быстрого получения качественной картинки.
krylov_sn
09.11.2022 17:57В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.
Тоже надо уточнить, что имеется в виду. Например на нашем микроскопе мы можем задавать напряжение от 5кВ.
K_Chicago
09.11.2022 22:32у меня впечатление, что SEM имеет не очень много областей практического применения, разве что для производства прикольных картинок разных частей насекомых для популярных бложиков..
Нет, серьезно.
Просвечивающий микроскоп из-за гигантского увеличения - однозначно революционный инструмент и с его помощью очень много продвинули в науке и технологии, а вот сканирующий...
Кстати, поделюсь прикольным случаем из моей жизни: в городе, где я живу, есть что-то вроде...ну, не знаю, как по-русски, что-то вроде мастерской со свободным доступом для желающих, этакий кружок умелые руки на стероидах, там стоит всякое оборудование и можно делать какой-нибудь свой проект. При оборудовании есть 1-2 человека которые за него отвечают и помогают желающим делать их желающих проекты.
Так вот получилось, что там у них стоит старый сканирующий микроскоп, его взяли списаным и смогли запустить. Немецкий, по-моему, управление из встроенного 286-го (?) компьютера под Windows 3.11, c дискетами.Так вот у них явная проблема - машина редкая, работает, а никакого хобби-проекта они придумать не могут, и желающих нет никаких. Типа, "и нафига оно там стоит и простаивает?"
Они приглашают желающих, устраивают этакие экскурсии, а спросишь - а какие проекты вы на нем делали - ответить им и нечего. Разве что рассказали что кто-то принес заплесневевшую фотопленку и они вот сделали фотографии этой плесени на желатине. Зачем - непонятно.А второй случай с SEM - мне рассказала знакомая, у них в университете стоит эта машина для студенческих проектов, она оператор этой машины, и у нее студенты делали снимки...презервативов где показывали разный размер пор в резине у разных брэндов. Студенты - весёлый народ :)
qbertych
09.11.2022 23:28+1Ну почему же. SEM — абсолютно незаменимый инструмент для полупроводниковой промышленности.
K_Chicago
10.11.2022 01:27да, согласен. Еще вроде структуру сплавов на изломе им смотрят. Но согласитесь, это очень узкое и очень специальное применение, в отличие от любых других микроскопов, включая и просвечивающий электронный.
koreec
10.11.2022 03:38Электронная микроскопия создавалась для физики и материаловедения. И там она используется. Всякие жучки - это так, баловство.
Грубо говоря, SEM это посмотреть что там на поверхности, а TEM - что внутри. Вот, наример, SEM показывает что "царапина" на самом деле совсем не царапина, а наоборот:
А TEM обясняет почему так:
TularemY
Спасибо за статью!
Давно хотела почитать, как электронные микроскопы устроены, но все руки не доходили.
А вирусы в электронном микроскопе просто божественны! *.*
InBioReactor Автор
спасибо, что читаете нас. Впереди будет много всего. Мы также есть в вк https://vk.com/inbioreactor
qbertych
А я скажу вам не спасибо, а ровно наоборот. Потому что после чтения в голове остается не то, чего ожидаешь от нормального научпопа, а гречневая каша вперемешку с недостоверными (а местами откровенно ложными) фактами.
Электронный пучок и электромагнитное поле — две огромные разницы. И зачем вам рентген? Вместо него можно обойтись много чем другим.
А без катодолюминесценции, значит, нельзя? Да, что такое растровая разновидность электронной микроскопии? Подсказка: в тексте вы упоминаете ее раз десять, но, похоже, даже не замечаете этого.
Простите, это даже не бред, это просто набор звуков. Ну и покажите мне пожалуйста люминесцирующий металл, мне он нужен.
Судя по дальшейшему тексту, вы и правда уверены, что у молекул есть цвет и что вся сложная микроскопия нужна именно чтобы его увидеть.
Как превратить это в нормальный пост? Да очень просто: выкинуть все, в чем не разбираетесь, и написать то, что вам интересно. Ну например "Смотрите как круто сейчас умеют совмещать электронную микроскопию с оптической! Там вот такие интересные алгоритмы, а еще вот такой крутой способ увеличить разрешение микроскопа — им, кстати, мозги лягушки просвечивали, а еще… " И будет отличная статья, за которой видно живого автора и то, что ему интересно.
А вы зачем-то стали делать из себя эксперта и писать фразы, которые сами не понимаете. И это все вперемешку с картинками ради картинок (КДПВ не имеет отношения к электронной микроскопии) и панчами как из школьных рефератов. Да еще и опубликовали эту ерунду в не самом плохом коммерческом блоге на Хабре. Не надо так.