Ни для кого не секрет, что существуют вещи и организмы настолько маленькие, что увидеть их невооруженным глазом просто невозможно. Однако за последние сто лет наука шагнула далеко вперед. И теперь мы можем не только посмотреть на инфузорию, но и увидеть собственными глазами атомы, и даже, буквально, пощупать рельеф микроструктуры кристаллов. А все благодаря электронной микроскопии… Давайте разберемся, как такое возможно.
Перед вами небольшой обзор на электронные микроскопы и их возможности.
Изображение вируса Эбола, полученное при помощи просвечивающей электронной микроскопии
Несмотря на то, что «электронная микроскопия» звучит очень современно, запатентована она была еще в 1931 году германо-американским инженером и изобретателем Райнхольдом Руденбергом. Это был настоящий переворот в области изучения микроструктур.
|
В световом микроскопе, которым на тот момент пользовались исследователи, изображение давали световой луч и незамысловатая конструкция из оптических линз. В электронном микроскопе (ЭМ) роль луча выполнял поток электронов в вакууме, фокусируемый, словно линзами, электромагнитными катушками. Изображение передавалось на флюоресцирующий экран, где его можно было детально рассмотреть. Данная технология позволила исследовать микроструктуры твердых тел, их локальный состав, а также электромагнитные поля. |
▎В чем суть электронной микроскопии?
Как уже было сказано, на исследуемый объект подается пучок электронов, который фокусируется на образце при помощи электромагнитного поля. «Точка» фокусировки электронов имеет не более 5 нм в диаметре. Для сравнения, толщина волоса — 80 000 нм. При соприкосновении с объектом электроны частично проникают внутрь, вытесняя родные электроны и фотоны образца, которые, в свою очередь, попадают на лучевую трубку, где и формируется изображение.
▎Каковы преимущества электронной микроскопии?
- Первое и основное отличие от светового микроскопа — увеличение. Профессиональный современный световой микроскоп может увеличить изображение в 2 тысячи раз. Электронный микроскоп дает увеличение до 300 тысяч при разрешающей способности 0,5 нм. На таком увеличении уже можно рассмотреть атомы.
- Второе существенное преимущество — при помощи спектрального анализа рентгеновского излучения, возбуждаемого электромагнитным полем, можно изучить химический состав образца в конкретных точках.
- В процессе можно воздействовать на исследуемый объект: облучать, нагревать, намагничивать или деформировать. И полученная картинка будет динамически изменяться.
- Имеется возможность зафиксировать процессы на фото- или видеосъемку в высоком разрешении.
- Исследователь получает электронно-оптическую информацию, которую можно дополнить данными, основанными на дифракции электронов с материалом исследуемого объекта. К примеру, определение показателей кристаллографии при использовании дифракционного контраста.
- В растровой разновидности электронной микроскопии можно рассматривать рельеф поверхности объекта при помощи анализа катодолюминесценции.
▎А каковы недостатки?
А вот недостатков много:
- Во-первых, в отличие от светового микроскопа, в котором образец можно просто поместить под окуляр, в ЭМ для работы необходим вакуум. Поэтому исследуемые образцы должны быть хорошо обработаны и зафиксированы. А потому невозможно исследовать живые объекты.
- Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.
- В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.
- Из-за повышенной чувствительности и хрупкости ЭМ нужно размещать абсолютно неподвижно, на виброустойчивой колонне, в здании без внешних магнитных полей.
- ЭМ создает исключительно черно-белые изображения.
- И, конечно, стоимость. Далеко не каждый исследовательский центр может позволить себе ЭМ. Он дорог и при покупке, и в обслуживании.
Теперь давайте рассмотрим основные виды электронной микроскопии.
А основных видов два:
- Трансмиссионная или просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
- Растровая или сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)
Нитчатая водоросоль в световом микроскопе (а), СЭМ (б) и ПЭМ (в)
▎Просвечивающий электронный микроскоп
ПЭМ похож на обычный световой микроскоп, но вместо луча света используется поток электронов, а длина волны намного меньше, чем фотонная. Поэтому изображения получаются в более высоком разрешении.
Вирус свиного гриппа в просвечивающим электронном микроскопе
Фокусировка электронного потока осуществляется при помощи электромагнитных и электростатических линз. Возникают даже присущие фотонным микроскопам хроматические аберрации. Только природа такого искажения абсолютно иная. Кроме того, за счет закручивания электронов вдоль оси пучка в линзе, возникают дополнительные искажения.
|
У ПЭМ очень высокое разрешение, что позволяет разглядеть атомы вещества и детально рассмотреть, к примеру, возбудителя вирусного заболевания. Собственно, с появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА), электронным микроскопом перестали активно пользоваться для определения вирусов. И дело опять в стоимости и трудоемкости.. |
ㅤㅤㅤПросвечивающий электронный микроскоп
▎Сканирующий электронный микроскоп
СЭМ позволяет получать изображение очень высокого разрешения. Узко сфокусированный луч электронов микрон за микроном сканирует поверхность изучаемого образца. СЭМ дает возможность, в том числе, получить трехмерное изображение. У данного типа микроскопов имеется большое количество датчиков, способных улавливать все вытесняемые электронами частицы: электроны, видимый инфракрасный и ультрафиолетовый спектры света, рентгеновское излучение.
|
В отличие от ПЭМ, работа которого похожа на работу оптического микроскопа, работа СЭМ напоминает устройство старого телевизора. В таких телевизорах есть электронно-лучевая трубка. По ней в вакууме проходят электроны, испускаемые электронной пушкой, и есть система корректирующих движение линз, которые могут фокусировать или отклонять электроны. В СЭМ все то же самое, только электронами обстреливают исследуемый объект, а не люминофоры экрана, а вся поступающая информация фиксируется различными детекторами.. |
ㅤㅤСканирующий электронный микроскоп
У СЭМ есть несколько принципиально разных режимов работы, которые зависят от детекторов.
Рассмотрим основные виды:
Изображение пыльцы, полученное путем детектирования вторичных электронов
Морфология интерфейса между оксидной и металлической составляющими, сделанная в режиме детектирования отраженных электронов
Анализ элементного состава микрокомпонентов полированного образца анодного шлака с помощью энергодиспрсионного спектрометра
Коррозия, распространяющаяся сквозь хромовое покрытие на стали. Изображение получено при помощи детектирования прошедших электронов.
|
Катодолюминесценция — это, по сути, способность вещества замещать оставленные после облучения электронами дырки, захватывая свободные электроны и выделяя световую энергию. Это свойственно для металлов: чистых и с примесями. Свет, производимый металлом с примесью, будет другого оттенка, что и будет фиксироваться детектором.. |
Изображение циркона, полученное
при детектировании катодолюминесцентного излучения
СЭМ может работать исключительно с твердыми образцами в вакууме. Поэтому для работы с жидкостями, их необходимо подвергнуть глубокой заморозке. Зато форма и размер образца могут быть любыми в пределах объема рабочей камеры. Продуктивность работы повышается при нанесении на исследуемый образец тонкого слоя токопроводящего материала.
Электронная микроскопия применяется во многих сферах науки и промышленности:
|
В некоторых сферах электронная микроскопия незаменима. Поэтому исследователи постоянно работают над усовершенствованием методов и возможностей в данной области. Рассмотрим некоторые из них. |
▎3D моделирование
В некоторых случаях, к примеру, в биологии и медицине, могут потребоваться не просто фотографии ультратонких срезов, а трехмерные изображения какой-либо ткани или организма.
Это возможно осуществить несколькими способами:
Принцип метода криоэлектронной томографии
В процессе КЭТ объект исследования постепенно поворачивается и изображения получаются под разным углом наклона. После этого все фотографии сводятся в одно 3D изображение. Минус метода в том, что образец получает высокую дозу излучения, за счет чего часть мелких деталей теряется в процессе исследования.
Раскрашенное изображение бактериофагов
(зеленые), поразивших кишечную палочку (голубые), сделанное в ФИЛ-СЭМ
Сложность метода в подготовке. Перед проведением операции необходимо защитить образец от части заряда. Для этого на сам объект, к примеру, кусок органа, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта — 100*100 мкм. Кроме того, метод очень долгий, а с увеличением глубины резки снижается качество.
Принцип метода ФИЛ-СЭМ
Ультрамикротом со специальной насадкой и вставленной лентой для срезов
▎Цветное изображение
Большим минусом ЭМ является черно-белое изображение. Однако и с этим ученые смогли справиться.
|
Самый простой метод — коррелятивная свето-электронная микроскопия (КСЭМ). Для окрашивания изображения один и тот же объект фотографируется в световом и в электронном микроскопе, а затем программа соединяет два изображения. Однако из-за разницы в разрешении изображение лишь радужно подкрашивается согласно распределению флуоресцентного красителя. Выделить микроструктуры таким образом не удастся. |
Коррелятивная свето-электронная микроскопия элементов цитоскелета
Ученые объединили КСЭМ с трехмерной световой микроскопией, уже известной нам ФИЛ-СЭМ и с микроскопией сверхвысокого разрешения (СР-микроскопия), которая позволяет получить большее разрешение за счет объединения на экране множества снимков.
Срез ядер нейронов при микроскопии сверхвысокого разрешения
Составив изначально изображение высокого разрешения, ученые резали образец лучами ионов. Изображение получало цвет за счет световой микроскопии структурированного освещения, позволяющего увеличить разрешение снимка в два раза за счет поочередной подсветки отдельных точек при фоновом свечении остального образца, и одномолекулярной световой микроскопии, при которой флуоресценция красителя активируется слабым лазером. Одномолекулярная микроскопия позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения свели вместе и получили полноценные цветные снимки. С помощью данной методики удалось разглядеть, к примеру, ультраструктуру нейронов.
Трехмерные модели ядер нейронов, полученные при коррелятивной микроскопии
Итак, электронный микроскоп — вещь, во многих сферах незаменимая. Ученые потихоньку нивелируют его минусы и решают проблемы, связанные с его использованием. Возможно, в скором времени, из минусов останутся только размер и стоимость. Хотя… Может, и это исправимо?
|
Автор: Соловьёва Софья, микробиолог. |
- Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Ф. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в двух книгах. Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. 303 с.
- Уманский Я. С., Скаков Ю. А., Иванов А. Н., Расторгуев Л. Н… Кристаллография, рентгенография и электронная микроскопия. — М.: Металлургия, 1982, 632 с.
- СиндоД. Оикава. Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. — М.: Техносфера, 2006, 256 с. ISBN 5-94836-064-4.
- Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology, 2(11).
- Efimov, A. E., Tonevitsky, A. G., Dittrich, M., & Matsko, N. B. (2007). Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: A novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy, 226(3), 207–217. doi.org/10.1111/j.1365-2818.2007.01773.x
- Peddie, C. J., & Collinson, L. M. (2014). Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. Elsevier Ltd. doi.org/10.1016/j.micron.2014.01.009
- Schalek, R., Kasthuri, N., Hayworth, K., Berger, D., Tapia, J., Morgan, J., … Lichtman, J. (2011). Development of High-Throughput, High-Resolution 3D Reconstruction of Large-Volume Biological Tissue Using Automated Tape Collection Ultramicrotomy and Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 17(S2), 966–967. doi.org/10.1017/S1431927611005708
- Wagner, J., Schaffer, M., & Fernández-Busnadiego, R. (2017, September 1). Cryo-electron tomography—the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. Wiley Blackwell. doi.org/10.1002/1873-3468.12757
-
https://biomolecula.ru/articles/tsvet-3d-i-sverkhvysokoe-razreshenie-novaia-razrabotka-v-mikroskopii
Комментарии (24)
SciTeam
09.11.2022 11:40+9
Одно из самых интересных изображений, полученных с помощью электронного микроскопа, показывает, что трансляция белка осуществляется несколькими рибосомами одновременно.
ssj100
09.11.2022 11:52+2то есть эти 2 тонкие нити это РНК или ДНК ?
SciTeam
09.11.2022 12:27+5Здесь ДНК нижняя тонкая нить, а РНК верхняя, на которой рибосомы синтезируют белок (более толстые структуры). Тут заодно показано, что транскрипция и трансляция у прокариот (организмов без ядра) происходят примерно одновременно.
bbs12
09.11.2022 21:06+1трансляция белка осуществляется несколькими рибосомами одновременно
Интересно, это один и тот же белок создаётся разными рибосомами? Или одновременно разные белки? По идее на одной нитке рнк могут сидеть тысячи рибосом и вот так штамповать белки? Какой механизм отвечает за расстояние между соседними рибосомами, а то на фото они как-то не равномерно расположены. Возможно всё-таки разные белки производят.
VoronaDragon
10.11.2022 15:01+1Насколько я знаю, у бактерий может идти трансляция одного белка несколькими рибосомами, у более высокоорганизованных точно не знаю. Разных белков точно могут, если активатор подошли одновременно.
Расстояние между рибосомами (по крайней мере, у тех, с которыми я работала) случайное, но не меньше диаметра одной рибосомы.
vilgeforce
09.11.2022 12:25+4Какой электронный микроскоп использовался для получения заглавной фотографии?
QDeathNick
09.11.2022 19:25И не очень понятно что на фотографии. Кто знает?
bbs12
09.11.2022 21:08+2"Две клетки мыши, находящиеся в стадии профазы. Микрофотография получена с помощью флуоресцентного микроскопа (масштабная линейка соответствует 5 мкм) ."
https://ru.wikipedia.org/wiki/Профаза#/media/Файл:3D-SIM-3_Prophase_3_color.jpg
InBioReactor Автор
09.11.2022 23:13Это микроскопия структурированного освещения. Микроскоп конкретно для этого фото использовался световой.
Ученые использовали данную методику в процессе разработки методов "окрашивания" изображений электронного микроскопа.
Об этом методе есть немного в конце статьи.
На изображении профаза митоза, визуализированная методом SIM
vilgeforce
10.11.2022 12:09+1Ну что ж вы так... Статья про электронную микроскопию, а заглавное фото - световое :-D
Dmytro_Kikot
09.11.2022 15:20+1Спасибо большое за увлекательный материал.
Мне это напомнило историю об Игнаце Земмельвейсе, который, будучи акушером, предложил коллегам мыть руки и инструменты (микробной теории тогда еще не было). Смертность снизилась в разы. Однако многие коллеги смеялись над ним, считая его теории глупостью. Затем его уволили и смертность вновь пошла вверх. Из-за этого у него произошел срыв, его насильно помести в лечебницу, где он и скончался (от избиений со стороны медработников). Зато спустя много лет предложенные им методики стали нормой.
koreec
09.11.2022 16:23+3Вот это просвечивающий электронный микроскоп:
А у вас на картинке дрова какие-то.
phenik
09.11.2022 17:31Поглощение электронного потока в образце, один из недостатков эл. микроскопов, снижающих их эффективность, возможно будет преодолен с помощью кв. запутанности, как это смогли сделали для оптических микроскопов (статья).
krylov_sn
09.11.2022 17:54+2Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.Неправда.
Если речь идет про TEM (трансмиссионный электронный микроскоп), то - да. Там и длительная подготовка образца нужна, и тонкий срез.
А вот в случае SEM (сканирующий электронный микроскоп), делать срез вовсе необязательно. Микроскоп может работать и на отраженных электронах. Подложка (например из кремния) обычно имеет толщину 1-2 мм, с маленькими структурами на ней микронного или нанометрового размера, толщиной в несколько нанометров. И замечательно все видно. Никто не срезает подложку. Как раз-таки SEM используется очень широко из-за относительной простоты подготовки образца и быстрого получения качественной картинки.
krylov_sn
09.11.2022 17:57В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.Тоже надо уточнить, что имеется в виду. Например на нашем микроскопе мы можем задавать напряжение от 5кВ.
K_Chicago
09.11.2022 22:32у меня впечатление, что SEM имеет не очень много областей практического применения, разве что для производства прикольных картинок разных частей насекомых для популярных бложиков..
Нет, серьезно.
Просвечивающий микроскоп из-за гигантского увеличения - однозначно революционный инструмент и с его помощью очень много продвинули в науке и технологии, а вот сканирующий...
Кстати, поделюсь прикольным случаем из моей жизни: в городе, где я живу, есть что-то вроде...ну, не знаю, как по-русски, что-то вроде мастерской со свободным доступом для желающих, этакий кружок умелые руки на стероидах, там стоит всякое оборудование и можно делать какой-нибудь свой проект. При оборудовании есть 1-2 человека которые за него отвечают и помогают желающим делать их желающих проекты.
Так вот получилось, что там у них стоит старый сканирующий микроскоп, его взяли списаным и смогли запустить. Немецкий, по-моему, управление из встроенного 286-го (?) компьютера под Windows 3.11, c дискетами.Так вот у них явная проблема - машина редкая, работает, а никакого хобби-проекта они придумать не могут, и желающих нет никаких. Типа, "и нафига оно там стоит и простаивает?"
Они приглашают желающих, устраивают этакие экскурсии, а спросишь - а какие проекты вы на нем делали - ответить им и нечего. Разве что рассказали что кто-то принес заплесневевшую фотопленку и они вот сделали фотографии этой плесени на желатине. Зачем - непонятно.А второй случай с SEM - мне рассказала знакомая, у них в университете стоит эта машина для студенческих проектов, она оператор этой машины, и у нее студенты делали снимки...презервативов где показывали разный размер пор в резине у разных брэндов. Студенты - весёлый народ :)
qbertych
09.11.2022 23:28+1Ну почему же. SEM — абсолютно незаменимый инструмент для полупроводниковой промышленности.
K_Chicago
10.11.2022 01:27да, согласен. Еще вроде структуру сплавов на изломе им смотрят. Но согласитесь, это очень узкое и очень специальное применение, в отличие от любых других микроскопов, включая и просвечивающий электронный.
koreec
10.11.2022 03:38Электронная микроскопия создавалась для физики и материаловедения. И там она используется. Всякие жучки - это так, баловство.
Грубо говоря, SEM это посмотреть что там на поверхности, а TEM - что внутри. Вот, наример, SEM показывает что "царапина" на самом деле совсем не царапина, а наоборот:
А TEM обясняет почему так:
TularemY
Спасибо за статью!
Давно хотела почитать, как электронные микроскопы устроены, но все руки не доходили.
А вирусы в электронном микроскопе просто божественны! *.*
InBioReactor Автор
спасибо, что читаете нас. Впереди будет много всего. Мы также есть в вк https://vk.com/inbioreactor
qbertych
А я скажу вам не спасибо, а ровно наоборот. Потому что после чтения в голове остается не то, чего ожидаешь от нормального научпопа, а гречневая каша вперемешку с недостоверными (а местами откровенно ложными) фактами.
Электронный пучок и электромагнитное поле — две огромные разницы. И зачем вам рентген? Вместо него можно обойтись много чем другим.
А без катодолюминесценции, значит, нельзя? Да, что такое растровая разновидность электронной микроскопии? Подсказка: в тексте вы упоминаете ее раз десять, но, похоже, даже не замечаете этого.
Простите, это даже не бред, это просто набор звуков. Ну и покажите мне пожалуйста люминесцирующий металл, мне он нужен.
Судя по дальшейшему тексту, вы и правда уверены, что у молекул есть цвет и что вся сложная микроскопия нужна именно чтобы его увидеть.
Как превратить это в нормальный пост? Да очень просто: выкинуть все, в чем не разбираетесь, и написать то, что вам интересно. Ну например "Смотрите как круто сейчас умеют совмещать электронную микроскопию с оптической! Там вот такие интересные алгоритмы, а еще вот такой крутой способ увеличить разрешение микроскопа — им, кстати, мозги лягушки просвечивали, а еще… " И будет отличная статья, за которой видно живого автора и то, что ему интересно.
А вы зачем-то стали делать из себя эксперта и писать фразы, которые сами не понимаете. И это все вперемешку с картинками ради картинок (КДПВ не имеет отношения к электронной микроскопии) и панчами как из школьных рефератов. Да еще и опубликовали эту ерунду в не самом плохом коммерческом блоге на Хабре. Не надо так.