^{Аптека в Африке, сейчас пациент получит одну таблетку доксициклина}

Бактерии — мастера генетических рекомбинаций. У них очень короткий цикл жизни, большое потомство, миллиарды попыток на мутации и очень короткая петля обратной связи. Одного этого достаточно, чтобы если не забрутфорсить, то найти решение проблемы алгоритмами группы Монте-Карло.

Плюс у них есть такая милая штука, как горизонтальный перенос генов. В смысле, бактерия может брать и раздавать свой код. Например, в виде плазмид — вынесенных за хромосому хранилищ ДНК. Это значит, что даже не надо проходить циклы размножения — достаточно одной приспособленной бактерии, которая встанет на раздачу. Причём раздаёт она разным видам, не только своему.

Поэтому антибиотики уже через 15 минут после появления начали резко создавать эволюционное давление.

Пенициллин вначале отбирали у плесени. Выращивали, срезали, макали в раствор, получали колбы с антибиотиками. И вот на краях этих колб почему-то уже тогда начали расти бактерии, для которых эта среда смертельна. Но тогда надо было работать работу и решили, что это какие-то неправильные бактерии, которые делают неправильный мёд. Тем более, что при повышении дозы они, вроде как, погибали.

В общем, там есть пара суперинтересных историй про то, насколько бактерии хитрые и продуманные. Пора бы в этом разобраться. Сегодня мы это делаем с экспертом — Денисом Кузьминым, к.б.н., директором физтех-школы биологической и медицинской физики МФТИ.

Что такое антибиотик?

Это штука, которая может убивать бактерии. В принципе, расплавленный металл тоже своего рода антибиотик, но если его принять внутрь, то это кончится печально и немного предсказуемо и для основного организма. То есть антибиотик — это что-то, что убивает бактерии и при этом не убивает остального человека. Это чаще всего работает на разнице бактериальной клетки и эукариотической, либо целится по конкретным сигнатурам бактериальных клеток.

Например, убивает нас и бактерии с разной скоростью. Собственно, это самый частый случай практики применения.

Промышленное производство антибиотиков изменило человечество — люди просто взяли и перестали умирать по самым частым на тот момент причинам. Ну, кроме голода. Вообще, антибиотики открывали несколько раз, но поначалу каждый раз это казалось прикольной, но не очень практичной идеей. В 1928 году Флемминг выделил пенициллин, в 1938 году Флори и Чейн решили проблему устойчивости, и только в 1943 году началось промышленное производство.

Вот зарисовка из «О всех созданиях – прекрасных и удивительных» ветеринара Хэрриота, как это выглядело для него впервые:

«По всей стране, по всему миру ветеринары в эти дни наблюдали первые ошеломительные результаты, переживая то же, что и я в тот день. Одни с коровами, другие с собаками и кошками, третьи с дорогими скаковыми лошадьми, с овцами, свиньями. И в самой разной обстановке. Но со мной это произошло в старом вагоне, приспособленном под телятник, среди ржавеющего железного хлама на ферме Уилли Кларка.
Разумеется, продлилось это недолго — то есть сотворение чудес. То, чему я стал свидетелем в этом телятнике было воздействием совершенно нового агента на ничем не защищенную популяцию бактерий. Дальше пошло иначе. Со временем микроорганизмы приобрели резистентность, и пришлось создавать новые, более действенные сульфаниламиды и антибиотики. Так что битва продолжается. Мы получаем хорошие результаты, но волшебных исцелений не совершаем, и мне очень повезло, что я принадлежу к поколению, которое видело самое начало, когда одно чудо следовало за другим.»

Собственно, он описывает золотой век антибиотиков, когда удавалось найти всё новые и новые молекулы. Пенициллин — бета-лактамный антибиотик, то есть он нарушает синтез клеточной стенки. Нашлись генераторы помех для удвоения ДНК (фторхинолоны), средства для разрушения мембран (линезолид, даптомицин), мы научились останавливать метаболизм собственных витаминов бактерий, ломать синтез белка тетрациклинами и макролидами. Появился арсенал около 20 основных групп. Все они убивали здорового человека медленнее, чем его популяцию бактерий. Их можно было более-менее внятно таргетировать, некоторые после доработок заодно не убивали наших бактерий-симбионтов или хотя бы тоже делали это аккуратнее.

Бактерии всё это время эволюционировали

Пенициллин оказался одним из самых простых для большинства популяций. Бета-лактам в основе? Ок, есть стандартная контрмера — можно выделять бета-лактамазу. Да, по изначальной архитектуре бактерий она вообще-то нужна была для другого и её синтезировалось довольно мало. Но, напоминаю, миллиарды быстрых попыток. Даже простой копипаст участка ДНК с генами, отвечающими за синтез — и вот её выделяется уже больше.

Проблема тут даже не в том, чтобы найти контрмеру, а в том, чтобы потом её отрефакторить, потому что защита может отжирать до 90% ресурсов, что не очень хорошо для выживания в нормальной среде без антибиотиков. Пенициллин лёгкий, довольно быстро выяснилось, что можно быстро и элегантно модифицировать код, чтобы бета-лактамы больше не были проблемой.

Или вот макролиды и тетрациклины ставят патч на рибосому — выделяют место, где можно поправить немного кода и делают так, что дальше ничего не компилируется нормально. Бактерии в ответ меняют это место посадки в рибосоме, переписывая тот же функционал другим кодом. То есть прячут сигнатуру этого участка. Не направленно, просто под эволюционным давлением антибиотиков делают те, кто так смог. И те, с кем поделились генами горизонтально.

У бактерий есть ещё много разных контрмер. Например, Acinetobacter baumannii отличается прикольной клеточной стенкой, покрытой липидной мембраной. Это как космическая станция с силовым щитом. Есть несколько портов, через которые бактерия может обмениваться веществами со внешним миром, и как только появляется угроза — она закрывает большую часть портов и пережидает. И это только половина проблемы. У подобных колоний есть чувство кворума — это механизм химической координации, позволяющей взаимодействовать коллективно. В простейшем случае каждая бактерия выделяет определённое количество маркера, и умеет считать этот маркер во внешней среде — когда его становится достаточно, колония понимает, что можно переходить к следующей фазе плана и образовывать те же бактериальные плёнки. Это то, что у них вместо более продвинутых механизмов координации клеток в многоклеточных организмах. Так вот, можно скачать плазмиды, которые добавляют к чувству кворума сигнал «срочно окуклиться», и мало того, что все бактерии закрывают порты, так ещё и запускают экстренные транспортёры и начинают откачивать изнутри всё неопознанное, что вымывает даже попавший внутрь антибиотик.

Вот прекрасная работа, которая показывает, как это работает в комплексе. Конъюгация (создание прямого соединения между бактериями) — 2 минуты, полное копирование информации — 10 минут, через час после попадания в популяцию около трети популяции получает F-плазмиду. Синтез TetA начинается немедленно после попадания ДНК в клетку, причем даже в присутствии в среде тетрациклина в концентрациях, подавляющих деление. Включается помпа, которая убирает из клетки тетрациклин. Деление ещё невозможно, но концентрация снижается достаточно, чтобы обеспечить синтез контрмер. Когда гены помпы удаляли, бактерии не могли сопротивляться тетрациклину даже при наличии плазмид с генами устойчивости в популяции.

Понятно, что годами они в таком режиме жить не могут, но и пациент обычно тоже.

В общем, им есть, что сказать в ответ на разные угрозы.

Такая история в той или иной степени касалась каждого антибиотика, который проходил испытания. Через 5-10 лет находилась эффективная контрмера, которая распространялась по бактериям по планете.

И «про всю планету» — это я серьёзно. Вот тут описывается, как быстро распространяется с помощью плазмид устойчивость. Ген blaNDM-1 нашли в 2008 году в Индии (то есть он чуть раньше появился у бактерий этого региона), а уже в 2013-м — в почве в Арктике на мысе Шпицбергена. Собственно, аналогичные случаи распространения были даже для Антарктиды. Почему так — потому что стоит бактерии встать на раздачу с чем-то полезным, как это будет расшарено по всему миру. Возможно, настолько быстро это получается из-за развития авиации. И да, этот ген мог появиться только в результате антропогенного влияния, то есть это не какой-то внешний древний фактор, который так удачно попался учёным в исследовании.

Вот обучающее видео на 2 минуты:

А в чём проблема-то?

В том, что люди очень привязаны к антибиотикам. Во-первых, они не дают умереть в частых ситуациях. Во-вторых, они дают возможность в принципе поесть. Потому что те же курочки живут в таком аду с точки зрения амплификации инфекций, что только конские дозы антибиотиков помогают их производить с нужной скоростью. Пока вы читали последнее предложение, кстати, погибло и родилось около 4 тысяч голов. А если вы читаете медленно, то от 6 до 8.

Ну и милые растения тоже как бы не очень рады, когда их жрут бактерии, особенно, когда вы увлекаетесь монокультурами. Поэтому антибиотики льются огромными дозами и в поля.

Экстраполяция известных данных по продажам вот в этом исследовании показывает, что сейчас только в животноводстве используется около 99 тысяч тонн антибиотиков в год. Про растениеводство вот.


^{Найдите Китай}

И вот если всё это перестанет работать, сначала будет нечего пожрать и откажет хирургия, а потом придётся с этим что-то делать. Прогноз пока очень оптимистичный — 300 миллионов смертей к 2050 году. Это только звучит ужасно, на самом деле — это не вымирание человечества и не супербаг, захватывающий мир.

С другой стороны, в 2019 году вышел отчёт, по которому антибиотикорезистентность — третья причина помереть после ишемических болезней сердца и инсульта. Речь про 5 миллионов смертей в год на планете с шансами дойти до 10 миллионов в год к 2050. Для сравнения, в ДТП ежегодно погибает около 1,3 миллионов человек.

В смысле, утрируя, вы боитесь рака, а погибнете тупо и неромантично либо от злоупотребления пиццей, либо от того, что кто-то решил вылечить простуду макролидами и вывел в себе вариант кишечной палочки с полирезистентностью.

В общем, так умирать как-то очень глупо, но шансы растут.

Что можно было сделать?

Первой идеей было не выпускать «обученные» бактерии из лабораторий. Предполагалось, что можно открывать новые и новые антибиотики, и тогда по мере новых эпидемий можно будет устраивать наивным бактериям сюрпризы. Учитывая клинические испытания на сотнях людей — и то, что скорость появления новых антибиотиков падает — это звучит как слабоумие.

Но ничего лучше у нас пока нет.

Второй идеей было договориться всем человечеством и не выпускать некоторые антибиотики в широкую практику, а держать как резерв. Там всё чуть хитрее. Дело в том, что любая защита усложняет код бактерий и начинает забирать лишние ресурсы там, где их нет. То есть в обычной среде этот код иметь невыгодно — вас вытеснят менее параноидальные коллеги. Предполагалось, что можно чередовать антибиотики так, что 10 лет мы не показываем тетрациклинины никому, бактерии привыкают, что их нет, оптимизируются, перестают поддерживать контур защиты от них, он разваливается — и вот через некоторое время они оказываются снова беззащитными. Вторая договорённость — не пускать в широкую практику антибиотики, которые бактерии вообще не видели, то есть держать линии резерва. Предпоследнюю и последнюю для Судного дня.

Как люди договариваются, мы прекрасно знаем. Два лучших примера — ковидные карантины и вакцинация.

Третьей идеей было усложнять сами антибиотики. Например, у нас есть амоксиклав. Это тот же пенициллин, только завёрнутый в клавулиновую кислоту. Бактерии выпускают бета-лактамазу, а клавулиновая кислота нейтрализует её, остаётся чистый пенициллин, который уже поражает их. В целом, бактерии могут довольно быстро по меркам эволюции найти агент, который нейтрализует и клавулиновую кислоту, либо, что происходит сейчас — просто начать делать другие средства разбирать бета-лактам. Для начала — кодируя производство бета-лактамазы другими генами и собирая её по другим рецептам, то есть точно такую же, только другую.

Эта гонка щита и меча приводит к усложнению антибиотиков и усложнению бактерий. Увы, но усложнение антибиотиков наступает быстрее, и предел выживаемости защищённой бактерии в нормальной среде и предел сложности антибиотика пока не пересекаются. Причин несколько — начиная от того, что это банально долго и дорого — и фармкомпании не хотят копать в сторону таких антибиотиков, когда можно производить почти в 20 раз быстрее окупающиеся антидепрессанты — так и то, что усложнение антибиотика ведёт к тому, что он становится всё более и более сложным в тестах. То есть либо его нельзя делать по современным правилам, либо разрабатывать ещё дороже.

С другой стороны, вот пример истории, когда бактерии защищаются от новой угрозы (вирусов), и при этом теряют резистентность к антибиотикам.

Что важно, если бактерия просто обзаведётся хромосомными мутациями, получится неподдерживаемый форк с костылями. Вероятность что это будет жизнеспособно — низкая. Но если отрефакторить это в отдельный микросервис, который совместим практически со всем, плюс положить в нормальный пакет обновления — плазмиду — то поддерживать такую плазмиду можно почти бесплатно, она же лежит и лежит, контейнер с ней выключен. Сами плазмиды могут (и чаще всего содержат) не только само средство, но и набор последовательностей для собственного копирования и встраивания. То есть идут сразу с API. И совместимость по мере встраивания в новые бактерии всё время тоже обновляется.

Казалось бы, ситуация довольно тупая. Открытие новых антибиотиков замедляется, способности компаний по их модификации становятся дороже, и остаётся, по большому счёту, внятно договориться о том, как антибиотики использовать и как их не использовать. И это решит большую часть проблем — ну или даст передышку.

Но есть нюанс.

Люди — идиоты

Во-первых, очень сложно ограничить потребление антибиотиков. Люди жрут их как витаминки. Вот мой прошлый пост про вирусы и антибиотики, там прекрасная Виктория Валикова рассказывает про африканскую практику пойти на рынок, купить одну таблетку и сожрать на всякий случай. Такова народная медицина. К счастью, у них нет дорогих антибиотиков — просто потому, что они дорогие. И их ещё надо запить.

Во-вторых, сами врачи назначают подряд. Это тоже связано с тем, что люди не самые рациональные. Пациент может просто пропасть и не прийти на второй приём (обычно они так и делают). Поэтому врач сразу прогнозирует самые частые варианты течения болезни и осложнения и даёт набор таблеток на этот случай. Потому что хреново, если на второй приём придёт предпокойник. Это может испортить показатели больницы. Поэтому есть отличные шансы получить рецепт прямо на первом приёме, даже если это вирусная инфекция, и она верно продиагностирована. Потому что через две недели может прийти ассоциированная бактериальная, а пациенту в голову не придёт появиться в больнице. Третья особенность — вообще-то правильно брать посев, смотреть на конкретного возбудителя и лечить его таргетированно, но пока посев будет готов (особенно в далёких больницах без лабораторий) — пациент уже помрёт. Поэтому обычно начинают с широкого спектра.

Хотя есть подвижки, вот описана возможность сильно ускорить тесты на восприимчивость к антибиотикам, до полутора часов.

В-третьих, сельское хозяйство. Там была вообще потрясающая история с колистином. Открыли в 50-х, очень обрадовались, но довольно быстро выяснилось, что примерно в половине случаев для человека он обеспечивает осложнения на почки. В 70-х в выборе «живой, но без почек» и «мёртвый, зато с почками» появилась третья опция использовать другие нормальные антибиотики, и колистин положили в группу последнего резерва. Сейчас его достают для тех пациентов, кто заражается какой-нибудь внутрибольничной синегнойной палочкой, и для обсуждения лечения уже привлекается плотник.

Но в сельском хозяйстве почки животных никого особо не волнуют, потому что до средних лет там редко кто доживает. В общем, его кидали в скотину просто тоннами (по одной из оценок, 12 тысяч тонн в год только официальный расход Китая). Причём его даже в какой-то момент запрещали и в сельском хозяйстве тоже, но не везде и не совсем.

Естественно, образовывались хромосомные мутации с устойчивостью, но дальше отдельной фермы обычно не шли и сами быстро погибали из-за общей кривизны кода. Но в 2014 году почему-то вдруг 21% образцов мяса во время мониторинга в Китае показал устойчивость. Начали копаться, нашли новый ген mcr-1, заботливо упакованный в плазмиду. Бактерии нормально чувствуют себя в среде без колистина, плазмида лежит и лежит, дополнительных ресурсов почти не требует. Появляется колистин — пакет тут же инсталлируется по всей популяции. В общем, теперь по всей планете бактерии имеют этот патч, и у нас стало на один антибиотик последнего резерва меньше.

А вот результаты 2019 года по тому, где и сколько антибиотиков в реках. Коротко — из 711 проб в 65% оказались антибиотики. В части стран с концентрацией выше предполагаемой безобидной. В Африке вода богата ципрофлоксацином, в Азии вместо антибиотиков на первом месте по дозировке — внезапно метформин, в Дунае и Темзе — больше 5 разных антибиотиков. В Пакистане из одной из рек можно было рассматривать воду как сырьё и добывать антибиотики промышленно, учитывая концентрацию.

И что делать?

Вытеснять. Раз защищённые бактерии такие сложные и так тяжело выживают в нормальной среде, можно засеивать места их обитания условно-безопасными бактериями, которые нам не вредят, зато обжирают или убивают патогены. Так уже делают, это трансплантация кала. В чистом виде без слова «кал» вы это знаете как пребиотики, — когда из биоматериала космонавтов выделены бактериальные культуры, которые уже не помнят, откуда они. Но и оригинальный кал тоже неплох, это работает. Пока известно, что пересадка микробиоты оказывается эффективнее антибиотиков в частных случаях. Ещё из практически-применимых колоний бактерий очень прикольно работают BLIS K12 и M18 — микрофлора, которая конкурирует с кариозными бактериями около зубов и инфекциями носоглотки. Если пойдёте в арктические экспедиции с кривоватой перегородкой носа — это очень пригодится.

Была идея с вирусами, которые убивают бактерии. Вирусы как нанороботы могут перерабатывать на себя таких же почти всё. Есть бактериофаги, и их стали оформлять в виде препаратов. Проблема с ними в доказанной эффективности. Её особо как-то нет. Точнее, они тяжело таргетируются, и могут убивать флору, но не особо различают целевую и полезную. Поэтому по совокупной полезности всё ещё хуже антибиотиков, и поэтому вы не видите, как аптеки ломятся от них. Перспективная работа там лежит в области CRISPR/CAS — можно делать вирусы, которые будут модифицировать код бактерий. По сути, новый технологичный бактериофаг. Возможно, он покажет лютую эффективность.

Современные антибиотики могут использовать новые мишени. Например, если раньше мы ломали клеточную стенку и саму ДНК бактерии, а бактерия училась этому противостоять, то теперь мы можем целиться в жгутик, которым она двигается. Можно немного поломать белки вращения жгутика, и вот привет БЕЗNОГNМ.

Вот так выглядит новый антибиотик зосурабальпин, он узкоспецифический.

Можно усложнять терапию, сочетая методы. Вот история про попытки внедрять наночастицы золота в двойные оболочки, что должно вести к повышению эффективности антибиотиков, потому что они смогут физически разрушать бактериальные стенки.

Большая часть того, что сейчас в исследованиях — переосмысление известного.

Денис считает, что можно и нужно эффективнее получать антибиотики. Есть прекрасные исследования про то, как анализуется сет возможных комбинаций с помощью нейросетевых моделей (благо, кодирование белков — это язык, почти как музыка или пиксели). Но там есть суперпроблема с тем, что это оно только в теории должно работать. А в мышке уже не факт, а потом при переходе от мышки к человеку ещё более никак. Но зато кандидаты ищутся быстрее. Это как CAD-софт вместо кульмана. Вот пример публикации. С другой стороны, рынок такой, что получить разрешение становится сложнее, испытания дороже, а эффективность майнинга антибиотиков всё время падала. И рынок стал важнее разработки, затраты на RnD обычно несколько миллиардов долларов — а на маркетинг могут быть в 2-3 раза выше. Плюс с антибиотиками есть куча проблем. Во-первых, от них пациенты выздоравливают. Это очень плохо, потому что не получается продавать годами. Хроника вроде антидепрессантов куда выгоднее. Во-вторых, стоимость курса низкая, максимум пара тысяч долларов для верхнего сегмента. Та же химия на порядок дороже, поэтому иммуномодуляторы выгоднее. В итоге это не самые выгодные средства с точки зрения рынка.

Собственно, итог в том, что антибиотикорезистентность пока что — пока что! — на практике не такая большая проблема, как кажется. С одной стороны, кишечная палочка с резистами убивает там, где нет современной медицины, внутрибольничные суперинфекции не вылезают за пределы больниц, и новой пандемии пока в планах нет. С другой — мы продолжаем лить антибиотики в реки и патчить бактерии по всей планете, и в какой-то момент, возможно, придётся стать экспертами-бактериологами, чтобы можно было выходить из дома. Даже тем, у кого нет собаки.

И да, с Денисом мы познакомились в нашем уютном сообществе упоротых гиков. Вступайте в ряды Фурье!