Даже самый значимый с точки зрения биологии процесс может протекать столь быстро, что мы его не замечаем. В попытках запечатлеть его мы либо улавливаем стадию «до», либо стадию «после», но особый интерес вызывает то, что происходит между ними. Особенно это важно для изучения работы клеток. Ученые из Осакского университета (Осака, Япония) разработали уникальную систему криооптической микроскопии, которая буквально замораживает клетки во время работы, что позволяет детально рассмотреть их в любой желаемый момент времени. Из чего состоит система, как именно она работает, и что нового она позволит узнать? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Методы флуоресцентной микроскопии широко применяются для изучения клеточной динамики биологических процессов, поскольку они позволяют визуализировать распределение молекул, ионные сигналы и молекулярные и белковые взаимодействия, а также клеточную морфологию. Более того, использование функциональных флуоресцентных зондов и/или применение методов внешней стимуляции, таких как электрическая стимуляция, изменение химических условий и механическая стимуляция, еще больше расширили спектр биологических исследований, доступных с помощью флуоресцентной микроскопии.

Изучение динамических биологических процессов, где распределение и состояние молекул и ионов меняются с течением времени, часто требует быстрой регистрации изображений для точного определения их совместной локализации, поведения и взаимодействий. Хотя улучшение отношения сигнал/шум (SNR от signal-to-noise ratio) дает очевидные преимущества, такие как повышение точности количественного анализа и пространственного разрешения, достижение высокого SNR при коротком времени получения изображений остается сложной задачей. Кроме того, необходимость быстрой регистрации изображений ограничивает применимость различных методов флуоресцентной визуализации, таких как получение изображений со сверхвысоким разрешением, трехмерная визуализация и флуоресцентная визуализация по времени жизни, которые могли бы предоставить более подробную информацию, но обычно требуют относительно длительного времени получения изображений, например, от нескольких сотен миллисекунд до нескольких минут.

В рассматриваемом нами сегодня труде ученые описывают методику, использующую простое, удобное в обращении устройство для быстрого замораживания in situ живых клеточных образцов и их субклеточной динамики в миллисекундном порядке во время наблюдения с использованием оптических микроскопических наблюдений с высоким пространственным и временным разрешением. Эта методика визуализирует путь биологической динамики, отслеживая временную информацию до фиксации, что позволяет быстро захватывать (фиксировать) клеточную морфологию, распределение ионов и химические состояния в произвольный момент времени во время биологического события, а также получать их снимки с высоким отношением сигнал/шум при длительном времени экспозиции в криогенных условиях.

Кроме того, ученые также разработали метод управления временем криофиксации с точностью ± 10 мс. Объединив этот точный контроль времени криофиксации с техникой оптической стимуляции, им удалось точно определить временной интервал между началом биологических событий и криофиксацией во время оптических микроскопических наблюдений. Хотя методы, основанные на быстрой заморозке (например, заливка жидким криогеном тканей или органов in vivo с последующей заменой замораживающего агента), ранее предлагались и применялись для наблюдения и анализа образцов с помощью оптической или электронной микроскопии, описанный в данном труде метод специально адаптирован для почти мгновенной иммобилизации клеточных образцов и их динамики в условиях оптической микроскопии, что открывает возможность последующих криогенных наблюдений с использованием различных методов оптической микроскопии.

Криофиксация давно используется для иммобилизации образцов в условиях, близких к их нативному состоянию. Хотя степень иммобилизации, необходимая для оптической микроскопии, менее строгая, чем для электронной микроскопии из-за ее более низкого пространственного разрешения, криофиксация все же имеет явное преимущество перед химической фиксацией в сохранении клеточных структур. Такое сохранение необходимо для анализа клеточных деталей с использованием методов флуоресцентной визуализации сверхвысокого разрешения. Более того, криофиксация может сохранять химическое состояние и окружающую среду в образцах, такие как окислительно-восстановительное состояние молекул, pH и концентрацию ионов, чего невозможно достичь традиционными методами химической фиксации, такими как использование параформальдегида. Также были признаны преимущества криофиксации при наблюдениях с помощью оптической микроскопии, включая повышенную фотостабильность молекул образца и улучшенный квантовый выход. Однако оптические свойства некоторых флуоресцентных зондов, например, фотопереключаемость или соотношение интенсивностей в пределах флуоресцентного спектра, могут отличаться в криогенных условиях по сравнению с комнатной температурой, а также демонстрировать температурную зависимость. Понимание этих различий имеет решающее значение перед проведением криогенных наблюдений образцов с использованием флуоресцентных зондов.

Недавно были предложены и продемонстрированы методы быстрого замораживания образца на предметном столике микроскопа, позволяющие проводить криофиксацию в определенные моменты времени во время наблюдений с помощью оптической микроскопии. Эти методы успешно продемонстрировали криофиксацию движения Caenorhabditis elegans во время флуоресцентной визуализации, достигнув криофиксации в течение 30 мс, а также криофиксацию клеток млекопитающих во время флуоресцентной визуализации с интервалами времени от нескольких секунд до нескольких минут. Последующие криогенные оптические наблюдения, включая суперразрешающую микроскопию и флуоресцентную визуализацию по времени жизни, дополнительно подтвердили их потенциал.

Результаты исследования

Изображение №1

Была разработана камера для замораживания образцов, которую можно разместить на инвертированном оптическом микроскопе (1a). Жидкий хладагент, состоящий из пропана и изопентана, вводился в образец в камере, чтобы живые клетки замораживались за счет теплообмена между хладагентом и образцом. Объем буферного раствора, окружающего клетки, был специально уменьшен для облегчения быстрого замораживания, без заметного влияния на наблюдаемые биологические процессы. При использовании этого метода остаточная высота буферного слоя оценивалась в 6.7 ± 2.5 мкм. Криоген поддерживался на образце, чтобы гарантировать его криогенную температуру во время оптических наблюдений. Камера для замораживания на предментом столике имеет конструкцию с открытым верхом, что позволяет стимулировать клетки путем изменения параметров буферного раствора перед замораживанием. Было установлено, что скорость дрейфа составляет всего 31 нм/с через 30 секунд после быстрого замораживания, что достаточно мало для предотвращения артефактов движения при флуоресцентной визуализации с использованием этой морозильной камеры. Также было показано, что морозильная камера на столике поддерживала температуру образца ниже температуры стеклования чистой воды (−136 °C) в течение примерно 3.3 минут, что достаточно для многих приложений, использующих флуоресцентную визуализацию.

Чтобы оценить степень образования кристаллов льда при использовании исследуемого метода замораживания, было проведено наблюдение с помощью криотрансмиссионной электронной микроскопии (крио-ПЭМ) клеток HeLa, которые были заморожены путем нанесения хладагента на образец. Результаты крио-ПЭМ подтвердили, что образование кристаллов льда внутри клеток HeLa практически не наблюдалось. Учитывая, что пространственное разрешение оптической микроскопии составляет порядка нескольких сотен нм, образование столь малых кристаллов льда вряд ли повлияет на качество изображения или биологическую интерпретацию с помощью оптической микроскопии. Это подтверждается результатами микроскопии со структурированным освещением (SIM от structured illumination microscopy), которые не выявили заметных повреждений или морфологических изменений в клетках, подвергнутых быстрой заморозке с использованием данной камеры.

Видео №1

Криофиксация проводилась с использованием морозильной камеры на столике микроскопа для наблюдения за активностью кальция, которая является одной из самых быстрых клеточных реакций. На 1b и 1c представлена серия флуоресцентных изображений кардиомиоцитов новорожденных крыс, нагруженных индикатором ионов кальция (Ca²⁺) Fluo-4, и профили интенсивности флуоресценции, отражающие волновой фронт Ca²⁺, распространяющейся в кардиомиоцитах новорожденных крыс. Во время наблюдения за волной Ca²⁺ вводился криоген, и движение волны останавливалось (видео №1). Этот результат показывает, что быстрое замораживание может сохранить не только морфологию клеток и распределение Ca²⁺, но и химическое состояние флуоресцентного индикатора, поскольку контрастность изображения практически не меняется до и после фиксации.

Ученые подтвердили возможность проведения наблюдений Ca²⁺ при криогенных температурах, измеряя интенсивность флуоресценции в диапазоне концентраций Ca²⁺, и обнаружили сигмоидальный отклик, аналогичный по форме отклику при комнатной температуре (1d). Чтобы сравнить характеристики с характеристиками при комнатной температуре, затем вводилась эффективная константа связывания K_cryofix, которая относится к точке перегиба на кривой отклика. При сравнении с K_d было обнаружено, что K_cryofix практически не изменился при быстром замораживании (294 против 306 нМ, 1d).

Интересно, что константа диссоциации K_d Fluo-4, как сообщалось, зависит от температуры. Это указывает на то, что если процесс замораживания достаточно быстрый, молекулярные отклики и пространственно-временные условия останавливаются, не проходя через состояние теплового равновесия. Это подразумевает, что состояние до замораживания сохраняется при быстром замораживании. В данном исследовании было также подтверждено, что интенсивность флуоресценции индикатора Ca²⁺, Fluo-4, увеличивается в криогенных условиях. Однако величина этого увеличения различалась в ядре и цитоплазме клетки. Поэтому важно оценивать эти области независимо при анализе пространственного распределения интенсивности, чтобы избежать ошибочной интерпретации. В ходе данного эксперимента использовалась одна и та же оптическая система при комнатной и криогенной температурах, поскольку спектры возбуждения и флуоресценции Fluo-4 при этих температурах существенно не различались.

Иммобилизация образца на предметном столике микроскопа может быть в полной мере использована различными методами визуализации. На 1e представлено флуоресцентное изображение сверхвысокого разрешения, полученное методом трехмерной структурированной иллюминационной микроскопии (3D-SIM) для Fluo-4 и SPY-555 (актинового зонда для живых клеток) в кардиомиоцитах новорожденных крыс. Это изображение демонстрирует сверхвысокое разрешение для визуализации ионов и связанного с ними поведения клеток, которое невозможно получить с помощью традиционных методов химической фиксации. Данный результат показывает, что длина саркомеров была немного короче в области высокой концентрации Ca²⁺ по сравнению с областью низкой концентрации Ca²⁺. Важно отметить, что темные пятна, наблюдаемые на изображениях Ca²⁺ в криогенных условиях, присутствовали уже до замораживания. Это подтверждает, что они не были вызваны процессом криофиксации. Эти характерные распределения интенсивности флуоресценции были обусловлены накоплением или отложением индикатора Ca²⁺ внутри клеток. Кроме того, было подтверждено, что пространственное разрешение SIM практически сохраняется после криофиксации в экспериментальных условиях.

Видео №2

Ученые также провели 3D-сверхразрешающую визуализацию распределения ионов Ca²⁺ в кардиомиоцитах новорожденных крыс с помощью 3D-SIM (1f, видео №2) после того, как распространение волн Ca²⁺ в кардиомиоцитах новорожденных крыс было остановлено криофиксацией во время наблюдения с помощью обычного широкопольного флуоресцентного микроскопа. Этот результат демонстрирует способность данной методики получать подробную трехмерную пространственную информацию о быстрых динамических клеточных процессах в определенный момент времени, что было значительно сложно визуализировать в условиях живой природы.

Видео №3

Помимо динамики ионов Ca²⁺, также было подтверждено, что метод криофиксации эффективно иммобилизовал движения различных субклеточных структур, таких как митохондрии (1g, видео №3) и лизосомы (видео №3). Для оценки степени морфологических изменений, вызванных криофиксацией, были рассчитаны погрешности измерения длины двухточечных флуоресцентных изображений до и после криофиксации с помощью основанного на B-сплайнах алгоритма неригидной регистрации. Погрешности измерения длины образцов митохондрий и лизосом аналогичны погрешностям измерения длины образцов, полученных методом экспансивной микроскопии.

Дополнительно было подтверждено, что даже через 15 минут после замораживания не наблюдалось заметных морфологических изменений, вызванных образованием кристаллов льда, при пространственном разрешении широкопольной флуоресцентной микроскопии, использованной в данном исследовании, хотя кристаллы льда могут образовываться при повышении температуры. Это позволяет предположить, что при данном уровне пространственного разрешения возможны наблюдения с более длительной экспозицией, что позволяет получать флуоресцентные изображения с улучшенным отношением сигнал/шум.

Изображение №2

Как показано выше, быстрая криофиксация на предметном столике микроскопа позволяет точно определить время фиксации во время наблюдения, что обеспечивает временную информацию о биологических событиях непосредственно перед криофиксацией и в момент ее проведения. Детерминированные временем характеристики особенно полезны в сочетании с технологией, инициирующей биологические события. Ученые использовали ингибитор Ca²⁺, способный модулировать концентрацию Ca²⁺ в клетках посредством светового облучения, для запуска волн Ca²⁺ в кардиомиоцитах новорожденных крыс перед криофиксацией. Для определения времени между подачей сигнала и криофиксацией был разработан инжектор криогена (2a), оснащенный внешним электрическим клапаном, который позволял впрыскивать жидкий хладагент в образец с точностью ±10 мс (2a). Используя оптическую установку, представленную на 2a, распространение ионов Ca²⁺ в клетке было заморожено через 120 мс после подачи сигнала на источник УФ-лазерного излучения (2b и видео №4).

Видео №4

Обращаясь к видеозаписи, записанной непосредственно перед этим, можно определить временные характеристики наблюдаемой клеточной динамики, которая подробно отслеживается с помощью криомикроскопа. Этот метод можно комбинировать с различными внешними стимулами, такими как электрическая стимуляция, изменение химического состояния и механическая стимуляция.

Видео №5

В качестве дополнительных примеров, на 2c и 2d показано, что можно избирательно применять криоген в фазах сокращения или расслабления кардиомиоцитов новорожденных крыс, что позволяет остановить сердечные сокращения, вызванные клетками (видео №5). Кардиомиоциты были загружены Fluo-4, и наблюдалось увеличение концентрации свободного Ca²⁺ в цитоплазме во время сокращения сердечного ритма, известное как Ca²⁺-транзиент. Как показано на 2c и 2d, кардиомиоциты новорожденных крыс были заморожены в моменты нарастания (фаза сокращения) и спада (фаза расслабления) интенсивности флуоресценции.

Изображение №3

Молекулы в криогенных условиях демонстрируют повышенную химическую стабильность, что может быть использовано для количественных измерений. Количественная оценка динамических образцов сопряжена с рядом сложностей в условиях окружающей среды, но значительно упрощается в криогенных условиях. Хотя предыдущие исследования сообщали о повышенной оптической стабильности флуоресцентных зондов в криогенных условиях, оптические свойства и количественные характеристики визуализации Fluo-4 и ратиометрического флуоресцентного зонда Ca²⁺, желтого хамелеона 3.60 (YC3.60), ранее не изучались.

Как показано на 3a, длительная экспозиция криофиксированного образца привела к более высокому SNR при флуоресцентной визуализации распределения Ca²⁺ с использованием Fluo-4 по сравнению с ограниченными временами экспозиции при динамической визуализации в условиях жизни (3a). Повышенная устойчивость Fluo-4 к фотообесцвечиванию в криогенных условиях также была полезна для улучшения SNR при визуализации Ca²⁺. Улучшение SNR приводит к соответствующему росту возможностей количественного анализа эксперимента. Например, точность измерения Ca²⁺ 0.2 нМ может быть достигнута с использованием Fluo-4 при 10-секундной экспозиции при -170 °C, что демонстрирует 17-кратное улучшение по сравнению с условиями измерения, которые можно было бы использовать при визуализации живых клеток (33 мс при 20 °C).

Ученые также исследовали YC3.60, который представляет собой голубой флуоресцентный белок ECFP, в паре с желтым флуоресцентным белком Venus, через чувствительный к Ca²⁺ кальмодулин. Оптические свойства и характеристики визуализации YC3.60 в криогенных условиях, как и у Fluo-4, ранее не изучались. Резонансный перенос энергии по Ферстеру (FRET) между ECFP и Venus облегчается захватом Ca²⁺ кальмодулином, а соотношение интенсивности флуоресценции ECFP и Venus может количественно измерять концентрацию Ca²⁺ в клетках. На 3b показано ратиометрическое флуоресцентное изображение клеток HeLa, экспрессирующих YC3.60 в цитозоле, и профили соотношения флуоресценции, полученные из линий, обозначенных красными и синими стрелками на 3b, полученные с помощью щелевого сканирующего гиперспектрального флуоресцентного микроскопа.

Клетки были криофиксированы через 36 секунд после стимуляции гистамином. Длительная выдержка в криогенных условиях позволила измерить спектр флуоресценции YC3.60 с более высоким отношением сигнал/шум (3c), что обеспечивает высокую количественную оценку Ca²⁺. Также был измерен кальциевый ответ YC3.60 при комнатной температуре и криогенных условиях при -180 °C после быстрого замораживания. Было обнаружено, что YC3.60 эффективно работает в криогенных условиях в широком диапазоне концентраций кальция (от нескольких десятков наномолей до микромолярного уровня).

После демонстрации применимости метода для измерения кальция ученые сравнили сигмоидальные кривые отклика зонда после быстрого замораживания с кривыми при комнатной температуре и обнаружили небольшое различие значений K_d и K_cryofix, а также изменение эффективности FRET (3d). Хотя необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизма изменения соотношения флуоресценции после быстрого замораживания, это может быть объяснено изменениями физико-химических свойств, такими как увеличение эффективности FRET вследствие увеличения времени жизни флуоресценции при низких температурах, более значительное увеличение квантового выхода ECFP по сравнению с Venus, изменение формы спектра испускания и, возможно, формы спектра поглощения. Несмотря на изменения этих физико-химических свойств, была достигнута ратиометрическая визуализация с высоким отношением сигнал/шум для количественной оценки концентрации Ca²⁺, что указывает на возможность использования различных зондов на основе FRET с детерминированной по времени криооптической микроскопией. Коэффициент флуоресценции при криогенной визуализации клеток был ниже, чем коэффициент, показанный на кривой титрования Ca²⁺, что может быть связано с разницей в условиях окружающей среды YC3.60 в клетках HeLa и калибровочном буферном растворе Ca²⁺.

Изображение №4

Криофиксация с детерминированным временем также полезна для мультимодальных исследований, поскольку переключение между различными модальностями не приводит к временному расхождению между режимами и обеспечивает одинаково точную картину во времени даже при использовании модальностей с различным временным разрешением, таких как флуоресцентная и рамановская микроскопия. В данной работе ученые продемонстрировали это с помощью мультимодальной визуализации одного и того же состояния клеток HeLa с использованием флуоресцентной 3D-SIM и щелевой сканирующей рамановской микроскопии (снимки выше).

Для экспериментов использовалась специально разработанная криокамера, установленная на предметном столике и оснащенная охлаждающим блоком, что обеспечивало быстрое замораживание клеточных образцов с последующим поддержанием низкой температуры во время спонтанной рамановской визуализации. Такой подход особенно важен, поскольку рамановская визуализация обычно требует сравнительно длительного времени получения изображения из-за изначально малого сечения рассеяния у внутренних молекул клетки.

После криофиксации клеток HeLa были получены сверхразрешающее флуоресцентное изображение актиновых филаментов и высокоразрешающая рамановская визуализация распределения цитохромов, белков и липидов. Как показано на снимках выше, рамановская микроскопия позволила четко отобразить пространственное распределение цитохромов, белков и липидов в криофиксированной клетке HeLa. Рамановские изображения были реконструированы на основе сигналов при 750 см⁻¹ (дыхательные колебания порфирина цитохромов), 1680 см⁻¹ (амид-I белков) и 2850 см⁻¹ (симметрическое колебание CH₂ липидов), соответственно. Актиновые филаменты в клетках HeLa были мечены SPY555 аналогично показанным на 1e.

Время регистрации изображений для флуоресцентной 3D-SIM и щелевой рамановской микроскопии составило 0.75 секунды и 25 минут, соответственно. Данная симуляция показала, что повышение температуры во время рамановской визуализации составляет около 1 °C, что не вызывает заметных повреждений образца. Несмотря на то, что в данном исследовании использовались лишь два метода микроскопии, возможно расширение подхода за счет применения широкого спектра оптических методик — таких как автофлуоресценция или когерентные рамановские методы, — что позволит увеличить мультиплексность наблюдаемых объектов и добавить дополнительные ортогональные данные визуализации.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые рассказали о новом методе визуализации клеток и процессов, протекающих в них, который использует криогенную заморозку.

Использование оптической микроскопии для визуализации клеток является одним из самых распространенных методов. Однако он не способен фиксировать динамические процессы с высоким пространственным разрешением.

Авторы исследования решили использовать холод, а именно метод крио-оптической микроскопии, позволяющий замораживать живые клетки в выбранный момент времени и получать высокоразрешающие изображения, которые сочетают пространственную детальность с количественной точностью. Такой подход позволил зафиксировать распространение кальциевых волн в кардиомиоцитах и наблюдать их в трех измерениях с помощью сверхразрешающей микроскопии, обычно слишком медленной для динамических процессов.

Фундаментальным элементом методики стала система инжекции криогена с электрическим триггером, обеспечивающая точность фиксации до 10 мс. Это позволяет фиксировать (останавливать) клеточные процессы с беспрецедентной временной точностью и проводить длительные экспозиции, недоступные в условиях живых клеток. В результате значительно повышается точность количественных измерений, например при использовании кальциевых флуоресцентных зондов.

Особое значение имеет возможность комбинирования различных методов визуализации без временного рассогласования. В рамках исследования ученые успешно объединили сверхразрешающую флуоресцентную микроскопию и спонтанную рамановскую микроскопию на одних и тех же криофиксированных клетках.

Данная методика становиться новым и крайне полезным инструментом для изучения быстротечных биологических процессов, помогая ученым более глубоко понимать механизмы, лежащие в основе клеточной динамики.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?