Интеллект человека позволил ему менять окружающий мир под себя, что, к сожалению, часто приводит к негативным последствиям для других обитателей планеты. Проблема в том, что мы чаще всего не замечаем этих катастрофических для экологии и биосферы изменений, пока не будет совсем поздно. Одними из важнейших для человека существ на Земле являются медоносные пчелы, которые участвуют в опылении растений, в том числе и сельскохозяйственных культур. Однако их численность сильно сокращается ввиду снижения продолжительности цветения, урбанизации и других факторов, которые приводят к голоданию. Использование пищевых заменителей пыльцы не дают желаемого результата, так как они не содержат важные для производства расплода стерины, которые присутствуют в настоящей пыльце. Ученые из Оксфордского университета (Оксфорд, Великобритания) разработали новый тип пищевых добавок, которые содержат все необходимое не только для поддержания популяции, но и ее многократного увеличения. Из чего сделана данная пищевая добавка, и насколько она эффективна в спасении пчел? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.

Основа исследования

Разводимые медоносные пчелы (Apis mellifera) играют основополагающую роль в современных сельскохозяйственных системах и глобальной продовольственной безопасности благодаря важнейшим функциям опыления сельскохозяйственных культур. Медоносные пчелы потребляют цветочную пыльцу, которая является источником белков, жиров, углеводов и микроэлементов. Все чаще сочетание изменений климата, землепользования и методов ведения сельского хозяйства ограничивает доступ медоносных пчел к достаточным и разнообразным цветочным ресурсам. Дефицит питательных веществ повышает восприимчивость пчел к болезням и гибели колоний, а также способствует растущим темпам потерь колоний медоносных пчел. Потеря опылителей, в свою очередь, снижает урожайность и повышает затраты на производство продуктов питания. За последние 40 лет пчеловоды перешли на практику кормления искусственными заменителями пыльцы, когда естественного корма недостаточно или когда пчелы содержатся в условиях высокой плотности. Однако коммерчески доступные заменители пыльцы, состоящие из белковой муки, сахаров и масел, не являются полноценными с точки зрения питания кормами для медоносных пчел. В таких диетах отсутствуют важные стерины, содержащиеся в цветочной пыльце, которые необходимы для здоровья и роста колонии.

Стеролы представляют собой структурно разнообразный класс тетрациклических тритерпеноидов, которые повсеместно важны для функционирования эукариотических клеток, в том числе для архитектуры мембран, биосинтеза гормонов и сигнализации. В отличие от других животных, насекомые и морские беспозвоночные утратили способность синтезировать эндогенные стеролы и вместо этого получают их из рациона. Большинство насекомых производят холестерин (CHOL от cholesterol) путем деалкилирования пищевых стеролов. В отличие от этого, медоносные пчелы утратили способность деалкилировать стеролы и вместо этого напрямую используют стеролы, полученные из рациона, в качестве мембранных вставок и в качестве предшественников экдистероидных гормонов. Большинство стеролов пыльцы, используемых пчелами, недоступны в количествах, которые можно было бы скармливать пчелиным колониям в коммерческих масштабах, что делает невозможным создание полноценного корма, который является заменой пыльцы.

Изображение №1

Рабочие пчелы, находящиеся в возрасте кормилицы, потребляют стеролы из запасенной пыльцы (перги). Стеролы накапливаются в их мандибулярных железах и передаются рабочим пчелам, матке и личинкам трутней через их секрецию (1a). Пыльца отличается высоким разнообразием стеролов, но, по-видимому, лишь несколько ключевых стеролов усваиваются рабочими пчелами в кишечнике и переносятся в расплод (1a, 1b).

Чтобы количественно оценить долю стеролов, обнаруженных у медоносных пчел, был проанализирован их состав в тканях куколок каждого типа. Δ5-стерол 24-метиленхолестерин (24-MC от 24-methylenecholesterol) составлял 60–70% стеролов в куколках (1b). Постоянно присутствовали пять других стеролов: β-ситостерол (SITO), десмостерол (DESMO), изофукостерол (ISOFUC), кампестерол (CAMP) и CHOL (1b). Относительное обилие каждого стерола, обнаруженного в куколках, варьировалось в зависимости от типа куколок (1b). Куколки трутней содержали на 11.8% больше 24-MC, чем куколки рабочих особей, и в 2.24 раза больше ISOFUC, чем куколки королевы. Куколки рабочих особей содержали по крайней мере в 1.5 раза больше DESMO, чем куколки королевы или трутня. CAMP был почти в шесть раз более обильным у куколок рабочих и королевы, чем у куколок трутней.

Общая концентрация стеролов в тканях куколок значительно варьировала между типами куколок и находилась в диапазоне от 130 до 260 мкг/г сырой ткани (1c). Общая концентрация стеролов в куколках трутней была выше, чем в куколках королев и вдвое больше, чем в куколках рабочих. Концентрации отдельных стеролов аналогичным образом варьировались между типами куколок. Пять из этих стеролов (SITO, CAMP, CHOL, ISOFUC и 24-MC) были среди шести наиболее распространенных стеролов, обнаруженных в пыльце (SITO, CAMP, CHOL, ISOFUC, циклоартенол и 24-MC). Анализ ранее опубликованных данных показал, что относительное содержание этих стеролов в пыльце цветков значительно различается. Наибольшее медианное относительное содержание имел SITO (40.9%), за ним следовали ISOFUC (9.50%) и 24-MC (5.84%), тогда как CAMP, CHOL и DESMO присутствовали в низких концентрациях (1d). Коэффициент вариации варьировался от 0.830 (SITO) до 2.99 (DESMO; 1d).

Для получения пыльцевых стеролов, необходимых пчелам, ученые использовали жирные дрожжи Y. lipolytica в качестве основы для производства стеролов. Эти дрожжи были выбраны из-за их высокой способности к накоплению липидов и обилия предшественника стеролов ацетил-КоА (ацетил-коэнзим А). Кроме того, использовался платформенный штамм с улучшенным переходом мевалонатного пути в сторону фарнезилдифосфата для увеличения поступления предшественников стеролов. Платформенный штамм получен из дикого изолята W29 и экспрессирует CRISPR-ассоциированный белок (Cas9), что позволяет редактировать геном.

Платформенный штамм — генетически модифицированный штамм микроорганизма, специально созданный как основа (платформа) для дальнейших метаболических инженерных модификаций и производства целевых соединений.

Этот штамм также сверхэкспрессирует четыре гена, кодирующих ферменты мевалонатного пути: HMG1, ERG12, IDI1 и ERG20. Включены также гены, участвующие в образовании ацетил-КоА, а именно АТФ-цитратлиазы 1 (ACL1) и ацетил-КоА-синтазы из Salmonella enterica (ACS). Платформенный штамм продуцировал почти в три раза больше эргостерола (ERGO, 1.95 мг/г сухой массы клеток [DCW от dry cell weight]), чем штамм дикого типа W29 (0.659 мг/г DCW).

Изображение №2

Эндогенный путь ERGO дрожжей может быть ремоделирован для синтеза альтернативных стеролов (схема выше). Однако предыдущие попытки синтеза ненационных стеролов в Y. lipolytica не увенчались успехом в достижении высоких удельных выходов или стереоселективности. У Saccharomyces cerevisiae гены, участвующие в поздних стадиях пути ERGO, не являются первостепенными, и альтернативные стеролы могут быть получены из окружающей среды при нарушении биосинтеза ERGO, например, в анаэробных условиях. Однако у большинства дрожжей, не относящихся к роду Saccharomyces, таких как Y. lipolytica, отсутствуют транспортеры захвата стеролов, и они не проявляют гибкой ауксотрофии по стеролам. По этой причине эндогенный синтез ERGO имеет важное значение, что делает сложным удаление генов последнего пути ERGO, таких как ERG4 (который кодирует Δ24(28)-стеролредуктазу) в Y. lipolytica.

Чтобы преодолеть эту проблему, ученые использовали стероловый суррогат. Ген STC1 из Tetrahymena thermophilia кодирует сквален-тетрахиманолциклазу, которая превращает сквален в пентациклический тритерпеноид тетрахиманол (TET от triterpenoid tetrahymanol), который может заменять функцию ERGO в дрожжах. Предполагается, что TET не окажет вредного воздействия на медоносных пчел, поскольку пыльца также содержит разнообразные стероловые интермедиаты и станолы, которые не накапливаются в тканях медоносных пчел. Ген SCT1 T. thermophilia был введен в платформенный штамм дрожжей под слабым промотором PrGPAT для достижения минимальной экспрессии и ограничения отвлечения потока углерода от стеролового пути. На долю TET приходилось 14% стеролов, продуцируемых в полученном штамме TET. Продуцируя TET в Y. lipolytica, ученым смогли эффективно манипулировать стерольным путем. Последующее устранение продукции ERGO в используемых штаммах также способствовало устранению ингибирования биосинтеза стеролов по механизму отрицательной обратной связи.

Изображение №3

Сначала был сконструирован Y. lipolytica для получения важнейшего стерола медоносной пчелы – 24-MC. Перенаправление пути синтеза стеролов Y. lipolytica с ERGO на 24-MC потребовало последовательного удаления эндогенных генов ERG4 и ERG5 (кодирующих стерол C-22 десатуразу) и введения гетерологичного гена DWF5 или DHCR7 (кодирующего Δ7-стеролредуктазу). Штамм erg4Δerg5Δ был использован для скрининга гетерологичных вариантов DWF5 и DHCR7, выявленных в геномах растений, животных, грибов и бактерий. Было отобрано десять различных вариантов, которые экспрессировались под сильным промотором PrTEFintron (3a). Штамм, содержащий DWF5 из Tetraselmis sp. (фитопланктон зеленых водорослей) продуцировал самое высокое содержание 24-MC (42.1 мг/г DCW) и накапливал меньше промежуточных продуктов TET и эргоста-5,7,24(28)-триенола, чем следующий по величине продуцирующий штамм, который экспрессировал DWF5 из Coccomyxa subellipsoidea (одноклеточная зеленая водоросль) (3a).

Штамм, продуцирующий 24-MC, был впоследствии модифицирован для создания штамма со смешанными стеролами, который продуцировал небольшие количества всех других стеролов, которые наблюдались у медоносных пчел (1b). Сначала вводилась Δ24(28)-стеролредуктаза (кодируемая SSR1) из картофеля Solanum tuberosum. Этот фермент восстанавливает боковую цепь 24-MC, продуцируя CAMP. Используя гетерологичный растительный вариант, можно было регулировать уровень экспрессии с помощью слабого промотора PrDGA1 и получить эпимер C-24α R CAMP, обнаруженный в растениях, а не эпимер C-24β S, как в ERGO. Полученный «двухстероловый» штамм продуцировал 24-MC (19.9 мг/г DCW) и небольшое количество CAMP (0.445 мг/г DCW, 3b). Затем был создан штамм, способный к продукции этилстеролов C-24, путем введения метилтрансферазы C-28 стеролов (кодируемой геном SMT) из Chenopodium quinoa (киноа) под контролем промотора PrGPAT. Этот «четырехстерольный» штамм продуцировал ISOFUC (0.396 мг/г DCW), SITO (0.145 мг/г DCW), 24-MC (21.6 мг/г DCW) и CAMP (0.245 мг/г DCW, 3b).

Для обеспечения продукции CHOL и DESMO ген, кодирующий Δ24(25)-стеролредуктазу (SSR2) томата Solanum lycopersicum, был экспрессирован под промотором PrGPAT в штамме с четырьмя стеролами, что привело к созданию конечного штамма со смешанными стеролами (3b). Δ24(25)-стеролредуктазы обычно встречаются у животных и восстанавливают DESMO до CHOL, но также присутствуют в растениях семейства пасленовых как часть пути синтеза гликоалкалоидов. При экспрессии в штамме S. cerevisiae, продуцирующем 24-MC, образуются как DESMO, так и CHOL. Аналогичное свойство наблюдалось и в созданном конечном штамме со смешанными стеролами, который продуцировал 24-MC (24.6 мг/г DCW), CAMP (0.433 мг/г DCW), ISOFUC (1.59 мг/г DCW), SITO (следовые количества), CHOL (0.396 мг/г DCW) и DESMO (0.898 мг/г DCW) при культивировании в малых масштабах (3b). Общее обнаруженное содержание стеролов снижалось с каждым раундом инженерии с 60.2 мг/г DCW в штамме 24-MC до 28.0 мг/г DCW в штамме со смешанными стеролами. Штамм со смешанными стеролами использовался для культивирования в биореакторах.

Ученые исследовали производство стеролов и биомассы, культивируя штамм 24-MC в режиме подпитки в контролируемых биореакторах объемом 250 мл. Содержание 24-MC достигло 8.72–12.0 мг/г DCW, а биомасса — 29.0–33.0 г DCW на литр после 150 часов ферментации. Для получения биомассы для тестирования в рационах медоносных пчел культивировался штамм со смешанными стеролами в режиме подпитки в 5-литровых биореакторах. После 84 часов ферментации содержание стеролов составило 8.46–9.76 мг/г DCW, а плотность клеток достигла 48.3–49.8 г DCW на литр (3c).

Относительное содержание стеролов увеличивалось в течение первых 24 часов, а затем оставалось стабильным. 24-MC составлял приблизительно 65% от общего содержания стеролов (3d). ISOFUC, CAMP, CHOL, DESMO и SITO вместе составляли 15% от общего содержания стеролов, а TET – оставшиеся 20% (3d). Также были ферментированы штаммы W29 и TET в 5-литровых биореакторах для использования в качестве контрольных образцов в экспериментах по кормлению. Содержание стеролов для этих двух штаммов достигало 0.100–0.118 и 0.099–0.204 мг/г DCW соответственно.

Предыдущие исследования ненативного образования стеролов в дрожжах достигли до 36 мг/г DCW эпикампестерола в Y. lipolytica и 19.3 мг/г DCW эпиэргостерола в S. cerevisiae в условиях ферментации. Первоначально удалось достичь 42.1 мг/г DCW 24-MC во время мелкомасштабного культивирования, что в восемь раз больше стеролов на единицу биомассы, чем в растительных маслах или цветочной пыльце. Этот результат демонстрирует полезность предварительно сконструированного платформенного штамма и потенциал Y. lipolytica в качестве основы для производства стеролов. Однако содержание стеролов снижалось с каждым этапом конструирования штамма и при масштабировании культивирования. Снижение содержания стеролов наблюдалось и в других исследованиях подобных штаммов во время культивирования в биореакторе. Тем не менее оптимизация метаболических путей, способность к хранению стеролов и условия роста для накопления липидов могут быть дополнительно улучшены для увеличения содержания стеролов в Y. lipolytica. Успешные стратегии для дрожжей включают регуляцию клеточного гомеостаза стеролов и перемещение ферментов в липидные капли.

Полученная в результате ферментации биомасса дрожжей была высушена и измельчена для создания рационов, которые можно было бы протестировать в полуполевых условиях с использованием колоний медоносных пчел. Высушенная биомасса дрожжей была включена в количестве 20% по массе в состав искусственного базового рациона, содержащего дополнительные белки, жиры, витамины и минералы, необходимые медоносным пчелам. Были протестированы следующие рационы: рацион со штаммом со смешанными стеринами (MxSt), рацион со штаммом TET (Tet), рацион со штаммом W29 (WT) и базовый рацион без дрожжей (базовый). Последние три использовались в качестве контрольных рационов. Поскольку штамм со смешанными стеринами продуцировал лишь следовые количества SITO, все рационы на основе дрожжей были дополнены коммерческой смесью фитостеринов, содержащей приблизительно 12.0% SITO. Базовый рацион также был дополнен коммерческой смесью фитостеролов для соответствия общей концентрации стеролов в рационе MxSt (0.340% масс./масс.).

Изображение №4

Был использован полуполевой метод с небольшими колониями медоносных пчел, чтобы измерить влияние различных диет на производство расплода при отсутствии поступающей пыльцы. Испытания кормления проводились в течение 3 месяцев и контролировали потребление рациона, состав стеролов, размер колонии и статус расплода (графики выше). Каждые 15 дней проводился подсчет расплода на стадиях яйца, личинки и куколки в каждой колонии, чтобы оценить способность каждого рациона поддерживать производство и развитие расплода. К сожалению, в течение первых 45 дней экстремальная волна тепла привела к сокращению пчел всех возрастов во всех колониях. Поэтому ученые пополняли колонии дополнительными пчелами-кормилицами на 32-й и 45-й дни. У пчел-кормилиц есть эндогенные стеролы, которые можно использовать для кормления личинок. По этой причине данные по расплоду анализировались, начиная с 45-го дня, когда ученые прекратили добавлять пчел-кормилиц.

Количество яиц менялось со временем, но не в зависимости от группы рациона (4a). Испытания по кормлению продолжались до середины сентября, когда производство яиц в колониях начинает снижаться с приближением осени. Таким образом, наблюдалось трехкратное сокращение откладки яиц с 45-го по 91-й день и соответствующее уменьшение количества личинок, расплода и взрослых особей. В целом количество личинок варьировалось в разных группах, и эффект рациона стал очевидным к 75-му дню (4b). На 75-й день в группе, получавшей рацион MxSt, было значительно больше личинок, чем в группе, получавшей рацион Tet. В группе, получавшей базовый рацион, также было больше личинок, чем в группе, получавшей рацион Tet. К 91-му дню количество личинок во всех колониях было низким. Низкое количество расплода в этот момент времени в группе, получавшей рацион MxSt, было обусловлено сезонным эффектом, который также наблюдается при кормлении колоний пыльцой.

Тип рациона значительно повлиял на расплод, выращенный до окукливания. Со временем влияние рациона на пчел усилилось, так что колонии, питавшиеся рационом MxSt, с большей вероятностью выращивали личинок до жизнеспособной стадии куколки (4c). К 75-му дню в группе рациона MxSt было значительно больше куколок, чем в группах Tet и WT. К концу эксперимента (91-й день) в группе MxSt также было значительно больше куколок, чем в группах базового рациона, Tet и WT. В группе с рационом MxSt во всех колониях, кроме одной, по-прежнему было 10–40 запечатанных ячеек расплода. Напротив, в группе с базовым рационом было 1–3 запечатанных ячейки расплода в 3 колониях, а в контрольных группах с дрожжевой диетой их не было. Данные для контрольных рационов (в которых отсутствуют необходимые стерины) были аналогичны наблюдениям за колониями, испытывавшими нехватку пыльцы, где скорость производства расплода является функцией продолжительности голодания по питательным веществам. В конечном итоге, во всех колониях, питавшихся рационами, в которых отсутствовали необходимые стерины (базовый, Tet и WT), у пчел-кормилиц не оказалось достаточного уровня ключевых телесных стеринов, необходимых для выращивания расплода.

Хотя количество куколок коррелировало с характером питания, уровни стеролов в выживших куколках варьировались меньше, чем у пчел-кормилиц, и достоверно не различались между группами, которым давали модифицированное питание. Более того, уровни стеролов в организме пчел-кормилиц показали меньшие колебания, чем в содержимом кишечника. Однако ни содержание стеролов в куколках, ни количество куколок не коррелировали с общим содержанием стеролов в организме пчел-кормилиц. В группах, получавших MxSt и Tet, TET накапливался в кишечнике пчел-кормилиц (до 42.4 мкг на пчелу), но в меньшей степени в телах (до 18.7 мкг на пчелу) и совсем не накапливался в куколках.

Пыльца содержит разнообразные стерины, включая циклопропиловые интермедиаты и станолы, но данные показали, что у медоносных пчел, как правило, накапливаются только Δ5-концевые интермедиаты стерольного пути. В экспериментах с дрожжевым кормлением штаммом со смешанным содержанием стеролов, пчелы-кормилицы переносили расплоду только ключевые стерины, вырабатываемые дрожжами (24-MC, ISOFUC, DESMO, CAMP, SITO и CHOL). Два рациона содержали суррогат стеролов TET, но в расплоде он не был обнаружен. Это открытие указывает на то, что у пчел есть селективные механизмы обогащения личиночного молочка ключевыми стеролами. Данные подтверждают предыдущие выводы о том, что медоносным пчелам, вероятно, требуется несколько стеролов для непрерывного производства расплода. Наиболее важными стеролами могут быть 24-MC и CHOL, поскольку колонии, питающиеся рационом без стеролов, дополненного 24-MC или CHOL, производят больше куколок, чем при добавлении SITO или CAMP.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

В рассмотренном нами сегодня труде ученые рассказали об разработанной ими инновационной пищевой добавке для медоносных пчел. Она была создана на основе дрожжей и обогащена шестью жизненно важными стеролами, характерными для пыльцы, — такими как 24-мэтиленхолестерол, кампестерол, изофукостерол, β-ситостерол, холестерол и десмостерол.

В ходе опытов в закрытых теплицах, где пчелы получали исключительно экспериментальные «стерол-обогащенные» рационы, исследователи обнаружили, что колонии, получавшие обогащенный рацион, вывели в 15 раз больше личинок до стадии жизнеспособных куколок по сравнению с контрольными группами.

Эти колонии продолжали производство расплода до конца эксперимента, тогда как колонии на рационе без необходимых стеролов прекратили воспроизводство спустя 90 дней. Стерольный профиль личинок в опытах четко соответствовал тому, который наблюдается у пчел, питающихся естественной пыльцой — что свидетельствует о селективной передаче пчелами только «биологически важных» компонентов потомству.

Ученые заявляют, что использование дрожжей Yarrowia lipolytica, генетически запрограммированных с помощью технологии CRISPR-Cas9 для синтеза ключевых стеролов, оказалось безопасным, устойчивым и жизнеспособным методом создания полного рациона — настолько, что эффект можно сравнить с переходом от скудного питания к полноценному рациону с необходимыми нутриентами.

Кроме того, новое решение обладает потенциалом значительного влияния на сельское хозяйство и биоразнообразие: более здоровые колонии медоносных пчел могут повысить урожаи (виды, которые зависят от опыления — яблоки, миндаль и др.), а обилие корма может снизить конкуренцию за ограниченные ресурсы среди диких пчел.

Исследователи также отмечают, что добавка, включающая дрожжевую биомассу с полезными белками и липидами, может стать основой комплексного корма для пчел. В будущем — уже в течение двух лет — возможны масштабные испытания на пасеках и применение этой технологии для других опылителей или сельскохозяйственных насекомых, что открывает перспективы устойчивого развития агроэкосистем.

Немного рекламы

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?